PNPLA3基因野生型及突变型过表达慢病毒载体的构建
目的：构建PNPLA3基因野生型及I148M突变型慢病毒载体,同时用GV358空病毒构建Huh-7稳转株. 方法：利用限制性内切酶消化GV358慢病毒获得线性化载体、PCR技术扩增PNPLA3野生型及突变型基因片段,后将两者进行重组反应实现线性化载体和目的基因片段的体外环化.重组产物感染感受态细胞,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及结果分析,并对正确克隆进行质粒抽提.将质粒抽提产物与病毒包装辅助质粒共感染293T细胞,通过收集病毒上清液并进行超速离心法得到高滴度的慢病毒保存液,得到的慢病毒保存液感染293T细胞进行表达检测.不同感染条件下,应用GV358空病毒感染Huh-7细胞,以明确病毒感染Huh7细胞的最适条件,同时用不同浓度的嘌呤霉素处理Huh-7细胞,确定后期构建稳转株时的最适浓度,后期应用该浓度进行病毒稳转株的筛选. 结果：(1)单克隆测序分析证实基因测序结果与PNPLA3CDS区序列及突变位点序列一致.(2)慢病毒感染293T细胞发现细胞内出现明显的荧光,Western Blot检测发现55KD附近处有特征条带.(3)MOI=20,应用Enis时细胞内可观察到明显的荧光;嘌呤霉素筛选4天后,1.0ug/ml及更高浓度组细胞死亡;稳转株构建时,嘌呤霉素筛选3天后,无细胞死亡,且荧光显微镜下观察到细胞均表达荧光. 结论：(1)荧光及Western blot表达证实成功复制了PNPLA3基因及I148M突变型慢病毒模型;(2)荧光表达证实MOI值取20且应用Enis为慢病毒感染Huh-7细胞的适宜条件;(3)构建Huh-7过表达细胞系的最适嘌呤霉素浓度为1.0ug/ml.
PNPLA3基因 野生型 突变型 慢病毒载体
许敏
中国医科大学附属第一医院
国内会议
贵阳
中文
574-592
2017-08-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）