RNAi沉默Nrf2基因对CTPE恶性转化BEAS-2B细胞的作用
目的:流行病学及动物实验均已证实煤焦沥青(coal tar pitch,CTP)具有致癌性,特别是对肺癌具有高度选择性.在正常细胞中,Keap1-Nrf2/ARE通路调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,保护细胞免受氧化损伤.该研究主要利用体外细胞实验，应用RNA干扰（RNA interfering, RNAi）技术沉默人支气管上皮细胞(BEAS-2B)中Nrf2基因的表达，建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株，随后建立CTP烟提取物诱导的BEAS-2B细胞恶性转化模型，在确定细胞发生恶性转化的基础上，动态观察不同代次细胞Keap1-Nrf2/ARE通路中相关基因及蛋白的改变，探讨RNA干扰技术沉默Nrf2基因对煤焦沥青烟提取物（CTPE）致BEAS-2B细胞发生恶性转化过程中的作用；为肺癌的发生机制提供线索。 方法：采用G418测定BEAS-2B细胞对其最低耐受浓度；小干扰RNA（si RNA）通过RNAi-Mate转染，从4条siRNA序列中筛选出1条沉默Nrf2基因的最佳序列，荧光显微镜观察及RT-PCR验证其结果；细胞转染si-Nrf2重组质粒过程中将细胞分为目的基因实验（si RNA）组、空白对照组、G418对照组、转染试剂对照（mock）组，RNAi技术沉默BEAS-2B细胞中Nrf2基因的表达，G418抗性筛选BEAS-2B细胞Nrf2基因沉默稳定表达株，RT-PCR检测各组细胞中Nrf2 m RNA的表达量。以BEAS-2B细胞为靶细胞，设立二甲基亚砜（DMSO）阴性对照组、苯并(a)芘（B(a)P）阳性对照组、煤焦沥青烟提取物染毒（CTP）组、RNAi组，建立细胞恶性转化模型，软琼脂集落形成实验分析细胞恶变情况，采用RT-PCR、Western blot技术分别检测10代、20代、30代细胞p62、Keap1、Nrf2、NQO1基因和蛋白的表达情况。 结果：各组细胞10代时克隆数30个以内；20代以后，RNAi组的克隆形成率显著高于其他组，差异有统计学意义（均P< 0.001）；B(a)P组和CTPE组Nrf2的m RNA和蛋白表达均较对照组显著增加（P < 0.001）；B(a)P组、CTPE组和RNAi组抗氧化基因NQO1的m RNA和蛋白水平均上调，但RNAi组的表达量显著低于B(a)P组和CTPE组，差异均有统计学意义（P < 0.001）。 结论：抑制Nrf2基因的表达能够促进CTPE诱导BEAS-2B细胞发生恶变；Nrf2可能通过上调NQO1的表达对抗CTPE对BEAS-2B细胞的毒性作用。
肺癌 发病机制 人支气管上皮细胞 恶性转化 Nrf2基因 RNA干扰 煤焦沥青
曹会敏 倪静 玉崧成 冯斐斐 吴拥军
郑州大学公共卫生学院 郑州450001
国内会议
中国环境诱变剂学会风险评价专业委员会第六届换届大会暨第十八届全国学术交流会
湖北宜昌
中文
250-251
2016-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）