人端粒酶逆转录酶基因小片段干涉RNA慢病毒表达载体的构建及其在宫颈癌caski细胞中的表达
目的：构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体. 方法：Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向人端粒酶逆转录酶hTERT基因特异性的小发卡RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT.通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性,将LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,将该重组慢病毒感染caski细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率.用制好的病毒来感染宫颈癌caski细胞后,流式细胞仪检测病毒感染率,荧光定量PCR法检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,采用cck-8法和细胞平板克隆法检测细胞增殖情况. 结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒.包装病毒后能够有效地感染宫颈癌caski细胞,荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干涉RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因表达.Anti-htert-LV组细胞增殖受抑制,生长速度较对照组生长缓慢. 结论：成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染caski细胞系.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使细胞增殖缓慢,为进一步的探讨hTERT基因在宫颈癌caski细胞中的发病机制和体外基因干预治疗方面奠定基础.
宫颈癌 病理机制 人端粒酶逆转录酶基因 基因表达 caski细胞 慢病毒表达载体
赵红珂 莫凌昭 李菲
广西南宁 广西医科大学附属肿瘤医院 妇瘤科 530021
国内会议
南宁
中文
294-306
2015-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）