应用LA-ICP-MS检测稀土元素标记的EPO单克隆抗体的检测方法研究
目的：促红细胞生成素(EPO)类兴奋剂多年来在耐力型运动屡见滥用案例,其中尤以自行车,游泳,长距离田径类运动中最为严重.根据世界反兴奋剂机构(WADA)发布的数据,全球范围内每年有数十例该类物质阳性被检出.作为耐力项目中最常见的兴奋剂物质类型,不断改进该类物质的检测方法、加大对该药物的检测力度是反兴奋剂工作的重中之重,并且对其他类型兴奋剂滥用的控制也可以起到极大的威慑作用.近年来DESI，DBD，LA等进样技术均为针对表面吸附的物质进行分析屡见报道，但在兴奋剂检测领域从未被应用，如和western blot的结合应用，并针对稀土元素标记的单克隆抗体进行检测，可以有效缩短检测时间。本研究主要针对该新方法进行实验条件摸索，用以检测运动员尿样中的外源性EPO。 方法：使用定量还原剂TCEP对WADA技术文件要求的EPO单克隆抗体的外侧二硫键结构进行还原，并使用DOTA鏊合物进行稀土元素标记。EPO使用经典的十二烷基肌氨酸钠电泳(Sarcosyl-PAGE)进行分离，并使用半干免疫印迹法转印至PVDF膜，并使用标记好的单克隆抗体进行孵育。PVDF膜最后使用激光剥蚀技术采样，使用ICP-MS对抗体上的稀土元素进行检测。本研究对不同浓度的还原剂，不同的稀土族金属，反应时的pH环境，使用的缓冲液体系等实验条件分别进行了摸索和优化，最终可以达到检测限40pg左右的尿样中外源性EPO。 结论：本研究开发的新检测方法可检出40pg左右的尿样中外源性EPO。与传统的辣根过氧化物酶—链霉亲和素化学发光体系相比灵敏度较差，但检测流程与现有经典常规方法相比，可缩短8～10小时；激光剥蚀虽煞会对PVDF膜表面产生不可逆的破坏，但灼烧点为微米级大小，仍可在同一张PVDF膜上进行反复检测。新方法在相关领域国内外从未见过应用，因此有较好的研究前景。后续研究可针对其他标记体系如Ru-NHS ester，p-SCN-Bn-DOTA等进行尝试。同时，该实验方法也可以应用到其他蛋白质类物质的分离和检测。
运动员 兴奋剂检测 促红细胞生成素单克隆抗体 激光剥蚀 电感耦合等离子体 质谱仪
张力思 邢志 河春姬 徐友宣 王娟 韦超
国家体育总局反兴奋剂中心 100029 清华大学分析测试中心 100084 Perkin Elmer(上海)仪器有限公司 201203 中国计量科学研究院食品安全计量实验室 100013
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杭州
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3116-3117
2015-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）