不同浓度尿样基质对GC/MS定量检测内源性甾体的影响
目的：使用GC/MS对尿样进行检测时,尿样基质对被测物都有一定的影响;尤其对定量物质,其积分面积因尿样基质不同而不同;因此,在检测过程中需定量加入已知浓度的内标,降低基质对定量结果的影响.2003年,世界反兴奋剂机构开始对全球范围的认可实验室进行统一管理,制定了一系列与常规检测相关的技术文件,其中2014年新执行的对内源性甾体定量检测的误差要求限制在15％之内.目前,实验室使用的检测方法是在1994年建立的,其能否满足新技术文件的要求,需要进行进一步的验证工作并根据结果适时加以改进. 方法：在日常检测中留存了30份来自不同人的高比重(d>1.030)尿样，将这30份尿样冷冻(-20℃)，然后解冻并混合、过滤沉淀，得到最终实验用初始尿样（d=1.033，pH=5.7）；将该初始尿样按比例(1/0，4/1，2/1，1/1，1/2，1/3，1/4)与纯水混合，得到7个不同浓度的实验尿样，编号为1＃-7＃，平行取3份不同浓度实验尿样各2mL，分别加入内标（甲基睾酮2500ng.D5-本胆烷醇酮250ng）、磷酸缓冲液1mL、B-葡萄糖醛酸甙酶2500units，55℃保温3小时，冷却至室温，加入20%碱性缓冲液0.5mL、叔丁基甲基醚4mL，混匀30秒，3000r离心3分钟，转移出有机层，55℃加热下用氮气吹干，加入混合衍生化试剂50μL，转移至200μL进样瓶、封盖，60℃反应30分钟，GC/MS进样分析。 结果：每个样品平行进样2次，使用相同积分参数对尿样中7种内源性甾体（睾酮T、表睾酮ET、雄酮An、本胆烷醇酮Etio、去氢表雄酮DHEA、5α-雄烷-3α，17β二醇5A-diol和5β-雄烷-3α，17β-二醇5B-diol）和2种内标（甲基睾酮、D5-本胆烷醇酮）进行自动积分，每个浓度的6个数据取平均值。内标甲基睾酮的积分面积在l＃尿样中最高，随着尿样的稀释，其积分面积逐渐降低，至7＃尿样，其积分面积只有l＃的75%;内标D5-本胆烷醇酮变化与甲基睾酮一致，只是下降幅度较小，7＃为1＃的90%。7种内源性甾体的积分面积也随着尿样的稀释而降低，降低比例与稀释比例不相符，降幅大于稀释比例使用内标进行校正后T.ET.An.Etio和DHEA使用氘代内标偏差较小，5B-diol使用甲基睾酮内标偏差较小，而5A-diol在使用这两个内标时偏差均大于15%;考虑到该药物定量离子较小，改为使用与其接近的内标甲基睾酮的第二个定量离子进行校正，这时5A-diol的最大偏差降到4%，同时5B-diol的最大偏差也降到7%。 结论：现行的检测方法在对不同浓度尿样基质进行检测时，只需微调内标的定量离子就能将偏差降到10%以内，满足技术文件的要求；为更全面考察尿样基质对定量检测的影响，后续还将进行相同基质不同浓度和相同比重不同基质相同浓度的定量研究。
兴奋剂检测 内源性甾体 基质浓度 气相色谱法 质谱法
刘欣 邢延一 王杉 邓静 张玉梅
国家体育总局反兴奋剂中心 100029
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3148-3149
2015-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）