使用LC-MS/MS技术检测人尿中去氨加压素及其在人体内代谢情况研究
研究目的：去氨加压素是人工合成的精加压素类似物,临床中常用于中枢性尿崩症、遗尿症、术中止血及某些出血性疾病的治疗,其主要原理为拮抗伸张集尿管中的V2受体,增加细胞水分的重吸收以达到抗利尿作用.有研究指出,口服去氨加压素并短时间内大量饮水后,会引起血液的快速稀释,使血细胞比容指标降低,间接影响到运动员血液生物护照的检测结果.鉴于此，世界反兴奋剂机构于2011年将去氨加压素列入禁用清单中的掩蔽剂类禁用物质列表中。去氨加压素是小肽类化合物，其前处理过程相比小分子物质更加复杂，因此在世界反兴奋剂机构认可的实验室中，仅有比利时和德国实验室建立了该药物的检测方法。本研究将基于液相色谱-串接质谱联用技术，改进已有的前处理方法，缩短前处理时间，建立适合本实验室检测条件的去氨加压素检测方法。同时，开展药物人体受试实验，通过检测受试的阳性尿样，研究去氨加压素在人体内的代谢情况，确定该药物的检测窗口期。 研究方法：1.检测方法的建立：首先使用液相色谱串接质谱技术建立去氨加压素原形的检测方法，优化液相色谱和质谱条件；选择固相萃取的方式对去氨加压素样品进行前处理，对实验步骤中淋洗液、缓冲液和洗脱液等进行优化，建立更加高效的前处理方法；从特异性、最低检测限和精密度等多个方面对建立的检测方法进行验证。2.代谢情况研究：共邀请八名年龄在21～25岁之间的健康志愿者受试，分别为四男四女。受试当天，留取空白尿后，服用0.2mg醋酸去氨加压素片（单次常规服药量），留取受试后第一天的全部阳性尿样及之后3天每12小时一次的阳性尿样；将收集到的阳性尿样经前处理后使用LC-MS/MS进行检测，根据实验结果绘制代谢曲线，作为该药物检测窗口期的参考数据。 研究结果：优化后的前处理方法平均实验时间为8小时，较现有方法至少缩短2小时；使用LC-MS/MS方法检测时，尿中去氨加压素的最低检测限为100pg/mL；线性范围为100pg/mL～20ng/mL，其相关系数R2>0.997；在高、中、低三个浓度下，检测方法的提取回收率均高于60％，日内及日间精密度均小于10%，基质效应在20%以内。通过对八名志愿者受试后阳性尿的检测后得出以下结果：八人的阳性尿中去氨加压素浓度峰值在服药后80～150分钟之间，最高浓度从200至2000pg/mL不等，平均检测窗口期为服药后10小时之内，最长可检测窗口期可达12小时。 研究结论：1.结论优化后的前处理方法较已报道的方法在保证提取回收率的同时，缩短了实验时间；建立了符合本实验室条件的去氨加压素检测方法。方法学验证数据表明，该方法对去氨加压素检测具有特异性，最低检测限满足世界反兴奋剂机构要求（2ng/mL）。人体受试实验显示，单次服用去氨加压素片（0.2mg）后的检测窗口期在10小时内，因个体差异，最长可达到12小时左右。2.建议：由于去氨加压素为小肽类，从人尿中纯化和富集的前处理方法比较复杂，暂时无法做到高通量样品的检测，因此需要从新的角度去考虑小肽类药物的前处理方式；本实验邀请八名志愿者参加药物受试，检测窗口期虽然较为平均，但可检测到的最高浓度差异较大，考虑到个体差异，需要增加受试样本量以对从人尿样中检测该药物的情况进行更加深入的研究；同时，仪器的灵敏度一定程度上决定了检测窗口期的长短，更加先进且灵敏度更高的仪器，将延长检测窗口期。
去氨加压素 尿液检测 液相色谱 串联质谱 代谢规律
闫宽 董颖 徐友宣 马艳华 张力思 杨志勇 冯飞飞
国家体育总局反兴奋剂中心 100029
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2015-11-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）