chNHE1受体Loop1域抗体阻断ALV-J病毒的研究
目的：J亚群禽白血病病毒(ALV-J)利用Na+/H+交换1型跨膜细胞表面蛋白(NHE1)作为受体实现其感染.NHE1膜外环结构域与ALV-J的相互作用,是病毒进入细胞的关键环节.NHE1第一膜外环(Loop1)是跨膜蛋白NHE1最大膜外环,是ALV-J与chNHE1结合关键域.为了确定Loop1是ALV-J与chNHE1相结合的关键域,以及Loop1抗体是否能够阻断ALV-J的感染,制备Loop1抗体,并且通过细胞毒性检测,免疫组织化学和荧光定量PCR方法检测Loop1抗体对AVL-J感染的影响. 方法：目的基因克隆测序：以chNHE1Loop1基因序列为目的基因设计引物，序列如下：上游5’-ATATATGAATTCGCCGACGCCACGCGTGTCT-3’下游5’-GAGCGAGATCTCGAAGGGGAGCGGCCGCATATAT-3’，以SPF鸡肾脏提取RNA转录为cDNA为模板，扩增获得全基因，连接转化阳性重组质粒测；构建表达载体：提取测序正确质粒转化到pGEX-6P-1表达载体中，大量表达蛋白，通过Blab/C小鼠制备chNHE1（Loop1）抗体；免疫组织化学检测：将确诊为ALV-J感染的120日龄海兰褐蛋鸡和同日龄SPF海兰褐蛋鸡同时做免疫组织化学检测，通过光学显微镜观察chNHE1在ALV-J在感染鸡和未感染鸡的差异；细胞毒性检测：用CCK-8试剂确定最适抗体工作浓度为100μg/ml；荧光定量PCR检测：将100μg/ml浓度Loop1抗体和ALV-J接种103TCID50100μL ALV-J同时接种CEF细胞，分别培养不同时间点，搜集细胞提取RNA，逆转录，进行相对荧光定量PCR检测病毒mRNA。 结果：1、免疫组织化学结果显示，观察到ALV-J感染鸡组化切片chNHE1表达量明显增高，证明在ALV-J可诱导chNHE1的表达。2、荧光定量PCR结果显示，Loop1抗体病毒联合作用组ALV-J基因表达量比病毒组表达量降低了2.1倍，而ALV-J的RNA水平降低了53％，对ALV-J感染具有明显的阻断作用，说明Loop1是病毒进入细胞的重要结合域。 结论：本实验通过Loop1抗体的制备，将anti-Loop1抗体与ALV-J同时接种CEF细胞，通过荧光定量PCR检测，接种anti-Loop1抗体可以有效的抑制ALV-J在细胞内转录与合成，因此证明了anti-Loop1可以有效阻断ALV-J病毒感染，其为ALV-J免疫抑制和致瘤机制的研究奠定了基础。
J亚群禽白血病病毒感染 1型跨膜细胞表面蛋白 Loop1域抗体 免疫抑制 致瘤机制
孟薇 庄萍萍 李根 冯卫国 成子强
山东农业大学 山东泰安 271018
国内会议
中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会第二十次学术研讨会
太原
中文
9-9
2015-07-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）