SIK1信号通路在高糖培养HepG2细胞中的表达及对糖异生的影响
目的：本实验采用体外培养的HepG2细胞,构建人SIK1基因的真核表达载体,从细胞和分子水平,对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的表达变化、对CRTC2及其下游糖异生通路的调控进行研究. 方法：采用人肝癌(HepG2)细胞,高糖组细胞用高糖(培养基中含25mmol/L glucose)培养,设立正常糖组,培养基中含正常浓度的糖(5mmol/L glucose),细胞培养24h后收集细胞,进行后续检测.同时,构建了携带SIK1基因的重组质粒pGV230-SIK1,以及空质粒、即Vector.采用阳离子脂质体转染法转染肝细胞后加入完全培养基培养48h,之后,分别加入正常糖和高糖培养基培养24h,收集细胞,进行后续检测.主要检测指标：RT-PCR检测细胞SIK1mRNA的表达,Western Blot检测SIK1信号通路相关基因的蛋白表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察高糖刺激下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况;免疫化学检测高糖对HepG2细胞内糖异生基因的表达;检测细胞培养液中葡萄糖含量. 结果：高糖培养HepG2细胞24h，与正常糖组相比，高糖组细胞的SIK1蛋白表达水平降低了77.6％;pT182-SIK1磷酸化水平降低66.3%；高糖组细胞的PEPCK表达明显增高细胞内的SIKI阳性信号明显从细胞质转移到细胞核，且信号表达明显减弱，高糖组细胞培养液中葡萄糖和细胞TG含量显著升高。 结论：①高糖刺激能够抑制SIK1的活性,肝细胞糖异生的通路激活,导致肝细胞糖异生增多;②增加SIK1的表达可减少肝细胞过多的糖异生;③高糖环境SIK1由细胞质向细胞核转移,虽然SIK1进入细胞核,但由于其蛋白表达和反映其活性的pT182SIK1磷酸化水平降到极低,在核内无能调控生糖基因;而高表达SIK1后,SIK1向细胞核转移,入核可磷酸化目的基因,可见pS171CRTC2磷酸化水平明显上调.
糖尿病 肝细胞 糖异生 盐诱导激酶1 基因表达 信号通路 高糖环境
文秀英 王畅 张悦 许明旺 宋道飞 李凝旭 郭源源
华中科技大学同济医学院附属梨园医院,武汉市430077
国内会议
中国中西医结合学会第四届实验医学专业委员会第十三次学术研讨会
北京
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2016-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）