基于人工核酸酶的新一代基因组编辑技术在斑马鱼中的应用
近年来,以锌指核酸酶(ZFN)和TALEN为代表的人工构建的序列特异性核酸内切酶为反向遗传学技术带来了革命性的飞跃.最近,基于Cas9核酸酶和向导RNA(gRNA)的CRISPR/Cas系统(又称Cas9/gRNA系统)正逐渐成为一种更为简便的基因组定点突变技术.然而,该系统的成功率、工作效率和特异性仍有待深入研究,特别是其脱靶效应仍存在争议.以斑马鱼为模式对上述问题进行了初步探讨。首先检测了斑马鱼中的28个位点，结果显示，常用的人源化的Cas9（humanized Cas9，hCas9）能够成功突变其中的9个位点，成功率为32％；而对90个位点进行TALEN介导的基因打靶实验结果表明，TALEN的成功率可达74%。为了提高Cas9/g RNA系统的成功率和打靶效率，根据斑马鱼的密码子偏好性优化了Cas9的编码序列（称为zCas9），结果成功突变了上述28个位点中的15个，即zCas9的打靶成功率可达54%；对于两者均有活性的位点，zCas9的效率均明显高于hCas9。为了检验Cas9/g RNA系统的特异性，编写了一个可以在任意已知基因组中寻找潜在脱靶位点的开放程序Cas OT（http://eendb.zfgenetics.org/casot/），在斑马鱼中预测了一个效率较高的靶点（~95%）的潜在脱靶位点，并选择了21个脱靶位点进行了深入分析。PCR扩增以及深度测序结果表明，该位点并没有明显的脱靶效应。上述结果表明，基于zCas9的Cas9/g RNA系统在斑马鱼中是一种高效、高特异性的基因打靶工具。
人工核酸酶 基因组编辑 脱靶效应 模式动物
刘达 肖安 王展翔 张雨田 程振朝 李文渊 孔雷 高歌 张博
北京大学生命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京 100871 北京大学生物信息中心,蛋白质与植物基因研究国家重点实验室,北京 100871
国内会议
厦门
中文
58-58
2014-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）