柞蚕凝集素基因的克隆及表达分析
凝集素(Lectins)是一种重要的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),广泛存在于动植物及昆虫中,它们常含有一个或多个糖基识别位点,参与了病原入侵及免疫反应.本实验通过RT-PCR和RACE-PCR的方法,克隆获得了柞蚕的一个凝集素基因(ApL3),全长1017bp,编码了308个氨基酸(其N端包含一个15个氨基酸的信号肽序列),蛋白分子量约为35kDa,理论等电点为4.99.生物信息学分析表明,ApL3有两个保守的糖基识别位点,属于C型凝集素超家族.利用半定量PCR方法研究了ApL3于不同组织的转录情况,结果表明,ApL3广泛分布于柞蚕的各组织,但在脂肪体中转录量最高.通过实时荧光定量PCR的方法,进一步研究了在不同病原微生物(大肠杆菌、枯草杆菌、白僵菌和核型多角体病毒)刺激下ApL3在柞蚕脂肪体中的转录情况,结果表明,于该几种微生物刺激下,均可导致ApL3的转录上调.随后,利用原核表达载体pET-28a对ApL3的ORF框进行了重组表达,纯化后制备了相应的多克隆抗体,western印迹分析表明,所制备的抗体能特异识别重组和内源性的ApL3蛋白,同时通过蛋白水平的组织定量检测,发现并进一步验证其在柞蚕脂肪体中表达量最高.本研究结果将为进一步研究ApL3基因的真核表达和其生物学功能及探索其应用提供参考.
柞蚕 凝集素基因 基因克隆 基因表达
林坤章 钱岑 田继武 朱保建 戴立上 张小娟 王道军 张学义 刘朝良
安徽农业大学 安徽合肥230036 河南省经济作物推广站 河南郑州450008
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2014-08-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）