miR-7-1启动子核心序列真核表达载体的构建及意义
目的: 构建miR-7-1启动子核心序列的真核表达载体,并初步探讨其意义. 方法: 根据5”端缺失实验原理,设计引物,PCR法分别扩增含不同长度启动子序列和相同miR-7-1成熟体序列的产物;纯化、经KPNI和XHOI双酶切后将它们分别亚克隆入pGL3.0-Basic真核表达载体,并进行酶切及测序鉴定;将三个构建成功的pGL3.0-miR-7载体(分别命名为p-1189-miR-7,p-1731-miR-7,p-2192-miR-7)体外瞬时转染小鼠乳腺癌4T1细胞;用Real-timePCR检测各组中miR-7成熟体的表达水平;CCK-8法检测细胞生长的变化;最后,利用TRANSFAC数据库预测结合miR-7-1启动子核心序列的潜在转录因子. 结果: 酶切和测序验证成功构建了p-1189-miR-7、p-1731-miR-7、p-2192-miR-7三个miR-7-1启动子真核表达载体;与表达载体p-1189-miR-7、p-1731-miR-7转染组相比,表达载体p-2192-miR-7瞬时转染4T1细胞后可有效表达miR-7成熟体,并显著抑制4T1细胞的体外生长(P＜0.05),提示miR-7启动子序列-1593位点到-2024位点为核心序列;最后,预测结果显示NK2-同源盒-5(NK2-Homebox-5,NKX2-5)和肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4 homeobox,HNF-4)可能是结合该核心序列的转录因子. 结论: 成功构建了p-1189-miR-7,p-1731-miR-7,p-2192-miR-7三个miR-7-1启动子真核表达载体,并筛选到miR-7-1启动子的核心序列(-1593位点到-2024位点),为后续深入研究miR-7-1在乳腺癌发生中的作用及机制提供了前期实验基础.
肿瘤细胞 微小核糖核酸-7-1 启动子 真核表达载体
徐华林 赵娟娟 褚风云 郭萌萌 崔盼盼 陈超 徐林
遵义医学院免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地 贵州 遵义 563099;贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室 贵州 遵义 563099 遵义医学院免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地 贵州 遵义 563099
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2016-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）