产单核细胞李氏杆菌溶血素O的定点突变和免疫原性研究
产单核细胞李氏杆菌（Listeria monocytogenes），是一种人畜共患的食源性病原菌，可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等，大约有30％的致死率。因此研制产单核细胞李氏杆菌的快速检测方法非常必要。溶血素O(Listeriolysin O，LLO)是产单核细胞李氏杆菌最主要的毒力因子，由hly基因编码。本研究的目的是对LLO进行定点突变，以期提高其免疫原性，制备高亲和力的单克隆抗体，提高产单核细胞李氏杆菌的检测灵敏度。本研究通过常规PCR方法扩增hly基因，构建重组质粒pMD18-T-hly，将扩增的hly基因的第52位的亮氨酸定点突变为苯丙氨酸，然后在将突变前后的扩增基因定向克隆到pET-28b载体中，分别构建原核表达重组载体pET-28b-hly和pET-28b-L52P。利用IPTG对重组子进行诱导，重组蛋白以包涵体形式表达，因此在变性条件下利用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行纯化，并将纯化后蛋白制成抗原，制备多克隆抗体，通过ELISA检测，LLO蛋白抗体效价为3×105，突变LLO蛋白抗体效价为6×105，并且测得突变LLO蛋白比LLO蛋白免疫反应性OD值增强0.44，P<0.05，这说明突变LLO的免疫原性明显增强。应用杂交瘤技术，将纯化后的突变LLO蛋白制各单克隆抗体，并确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件，以建立的该方法对融合后杂交瘤细胞进行检测筛选，共获得阳性杂交瘤细胞株II株。利用有限稀释法进行3次亚克隆后，最终获得单抗2株，分别命名为286和SD3，腹水ELISA效价以286较高，可达1:320000，平均腹水中抗体效价要比细胞上清中高大约533倍，此单克隆抗体的获得为产单核细胞李氏杆菌溶血素O的研究以及快速诊断方法的建立奠定了基础。
动物医学 产单核细胞李氏杆菌 溶血素O 定点突变 免疫原性
孙晓飞 祁保民 唐雪明 赵凯 姚金水
福建农林大学动物科学学院,福州,350002 上海市农业科学院生物技术研究所,上海,201106
国内会议
2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会
北京
中文
19-19
2012-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）