基于MLPA和外显子组测序的杜氏/贝氏肌营养不良症分子诊断新方法研究
杜氏/贝氏肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)可分为两种类型,即DMD和BMD.DMD这是最常见致死性的X-连锁隐性遗传性肌病,以进行性肌萎缩无力伴小腿腓肠肌假性肥大为主要典型临床特征.约75％DMD患者存在一个或多个外显子大片段缺失或重复,剩余约25％被认为存在微小突变,包括点突变、小的插入缺失、复杂的微小重排等.在多数情况下,微小突变会导致翻译的提前终止,形成功能不全的截短蛋白,从而引起疾病的发生.将多重连接依赖性探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)应用于DMD/BMD的分子诊断.对来自18个家庭临床上怀疑为DMD的患者进行了MLPA分析,在6个患者的DMD基因中检测出1至多个外显子缺失(其中2例为新生突变),1例为外显子重复突变.应用MLPA对两个DMD高风险的孕妇进行了产前分子诊断，结果在其中一个胎儿的DMD基因中检测到与先证者一样的缺失突变，而另一个未测到与先证者一样的突变。对一具有典型DMD/BMD的临床表现，但MLPA未检测到DMD基因外显子缺失(或重复)的患者，利用第二代测序技术，对其外显子组进行序列测定。在其DAD基因上发现一个突变:X_31950196_C/G，并通过Sanger测序法验证了这一突变。该突变位于DMII基因的关键剪接供体位点上，可能会影响所在内含子的识别和剪接。通过生物信息学工具对这突变进行预测，发现该突变点所在的5’端剪接供体位点失效了，并可能导致剪接方式的改变。为进一步研究这一突变的致病机制，利用杂种小基因剪接试验(hybrid minigene splicing assay,HMSA)，从细胞水平上分析病人和正常人DAB基因中该突变相关位置可变剪接的变化情况。将与该突变相关的侧翼序列插入到pcDNATM3.1/Hygro (+)载体中，并瞬时转染HeLa细胞，取其总RNA，采用RT-PCR技术分析可变剪接产物的表达情况。与正常对照相比，RT-PCR产物的序列测定显示:病人由于突变导致其剪接位点散失，产生两种转录产物:一种是相应内含子保留，为主要产物;另外一种利用相应替代性剪接供体位点。这两种情况与在生物信息学预测的结果相符。两种转录产物在翻译时其相应肤链C端氨基酸序列有所改变、终止密码提前出现，不能形成具有功能的蛋白质。
肌营养不良症 分子诊断 多重连接依赖式探针扩增技术 外显子组测序
丘丽萍 林炎鸿 严爱贞 周春燕 郭小燕 兰风华
南京军区福州总医院(厦门大学附属东方医院)临床遗传与实验医学科,福州,350025
国内会议
第九届全国遗传病诊断与产前诊断学术交流会暨产前诊断和医学遗传学新技术研讨会
兰州
中文
130-131
2014-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）