鸡T细胞表面抑制性受体PD-1及其配体PD-L1基因的克隆及原核表达
为获得鸡T细胞表面抑制性受体PD-1及其配体PD-L1蛋白，用于制备其单克隆抗体并研究PD-l:PD-Ll通路及其对鸡免疫抑制性疾病诱导T细胞免疫抑制作用。本研究根据GenBank上鸡PD-1和PD-L1预测序列，设计二者特异性克隆引物，以鸡外周血淋巴细胞提取的总RNA反转录的cDNA为模板，利用PCR技术获得PD-1及其配体PD-L1全长基因片段。将鸡PD-1和PD-L1片段克隆于pMD18-T-simple载体，构建重组克隆载体pMD-PD-1和pMD-PD-L1，鉴定并测序后构建PD-1和PD-L1原核重组表达载体pET-28a-PD-1和pET-32a-PD-L1。将其转化至Rosetta(DE3)表达菌株中，通过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间进行优化，并通过SDS-PAGE对蛋白产物进行分析以确定该蛋白最适表达条件。测序结果表明，成功扩增出468bp的鸡PD-1全长基因和669bp的鸡PD-L1全长基因。SDS-PAGE分析结果显示，本研究所构建的pET-28a-PD-1原核表达菌体在37℃,IPTG 0.1mmol/L诱导4h可获高效表达的分子量为20ku的FD-1目的蛋白，而pET-32a-PD-Ll原核表达菌体则在30℃,IPTG 0.4mmol/L诱导4h可获高效表达的分子量为44ku的PD-Ll目的蛋白，二者均以包涵体形式存在。本研究利用分子生物学技术，成功的获得了鸡的PD-1和PD-L1全长基因片段及其蛋白产物，为其单克隆抗体制备、阻断PD-1:PD-Ll通路以及对鸡免疫抑制性疾病诱导T细胞免疫抑制反应的恢复奠定基础。
鸡T细胞 免疫抑制 程序性死亡分子1 程序性死亡分子1配体 全长基因片段 克隆技术 原核表达
王选年 李博文 孙国鹏 王爱国 张艳芳 朱艳平 银梅
新乡学院,生物技术研究中心,生命科学与技术系,河南新乡,453003 新乡学院,生物技术研究中心,生命科学与技术系,河南新乡,453003;河南科技学院,动物科学学院,河南新乡,453003 河南科技学院,动物科学学院,河南新乡,453003
国内会议
郑州
中文
594-594
2013-11-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）