西尼罗病毒NS1基因重组腺病毒的构建
目的:主要通过对WNV-NS1基因重组腺病毒的构建,对西尼罗病毒病的预防进行探索性的研究.方法:pMD18-NS1(AY842931.3)重组质粒由本实验室保存;AdEasyTM Adenoviral Vector System试剂盒(携带腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183 感受态菌)、腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV以及Ad-293细胞由哈尔滨兽医研究所猪病研究室仇化吉研究员惠赠.应用重组腺病毒构建系统,以细菌内质粒间同源重组法构建复制缺陷型腺病毒.以pMD18-NS1重组质粒为模板,应用PCR技术,克隆目的基因,经酶切连接到pShuttle-CMV穿梭载体,经PmeⅠ酶切线性化后,电转入含有腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞中,同源重组,利用卡那霉素平板筛选阳性质粒,经酶切鉴定后,重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,经脂质体Lipofectamine2000转染人胚肾细胞(AD293细胞),用IFA、Western blot检测WNV-NS1 蛋白在AD293细胞内的表达,连续传五代,用PCR 检测目的基因,并测定其病毒滴度.结果:重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定,获得特异性的目的片段,转染AD293细胞后有明显的细胞病变效应,利用IFA、Western blot检测及PCR鉴定,WNV-NS1基因重组到腺病毒的因组中,并随着病毒的复制而表达.第四代重组腺病毒TCID50为:10-7.64/0.1ml.结论:西尼罗病毒NS1蛋白在病毒复制以及免疫保护方面发挥着重要作用,本实验成功的构建出了携带WNV-NS1基因的重组腺病毒,为NS1蛋白的功能研究以及西尼罗亚单位疫苗研制奠定基础.
西尼罗病毒 蛋白表达 基因重组 腺病毒
刘二战 孙恩成 杨涛 徐青元 吴东来
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001;吉林农业大学 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001
国内会议
2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会
南京
中文
22-22
2013-08-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）