荧光定量RT-PCR检测猪PD-1和PD-L1 mRNA方法的建立
目的:本研究为建立荧光定量RT-PCR检测猪PD-1及其配体PD-L1mRNA的方法。方法:根据GenBank中猪PD-1和PD-L1的基因序列，分别设计2对特异性引物，PCR扩增目的基因片段，回收与pMD18-T连接后转化DHScx，提取重组质粒，作为标准品，制备标准曲线，并进行特异性、重复性和应用性检测。结果:标准曲线PD-1和PD-L1两个样品相关系数Rz分别为0.997和0.998，均大于0.99，线性关系好，扩增效率分别为86.03％和102.40%;溶解曲线出现狭窄单一峰，荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，出现单一目的条带，无引物二聚体，特异性强;检测PD-1和PD-Ll组间的变异系数分别为0.592%和0.847%，重复性好;应用性结果表明，正常猪外周血单核细胞中PD-1和PD-Ll的基因表达水平稳定，该检测方法的稳定性好。结论:本试验建立了实时荧光定量RT-PCR检测猪PD-1和PD-Ll基因表达量的方法。荧光定量PCR技术以敏感性高、特异性强、操作简便以及定量准确被广泛应用，SYBR Green Ⅰ染料法由于成本相对较低，多用于基因的相对定量，SYBR Green Ⅰ与扩增片段双链DNA结合，发出强荧光信号，被仪器捕获，也可以与引物二聚体结合，影响特异性，该方法对引物的要求高，引物间和引物自身都不能形成二聚体。本试验中3对引物的溶解曲线出现狭窄单一峰，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现单一目的条带，无引物二聚体，说明建立的方法特异性高。本研究建立的荧光定量RT- PCR检测PD-1和PD-Ll的基因表达模式，为进一步研究猪免疫抑制性传染病如CSF,PRRS感染后，PD-1和PD-L1的表达模式奠定基础.从而进一步丰富猪免疫抑制性传染病引起的免疫抑制机理。
猪免疫学 程序性死亡分子1 基因序列 荧光定量检测
王选年 岳锋 朱艳平 张艳芳 孙国鹏 李鹏 银梅 杨媛
新乡学院,新乡453003
国内会议
2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会
南京
中文
45-45
2013-08-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）