猪PD-1和PD-L1胞外区基因的克隆、鉴定及原核表达
为了研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制病中的作用，根据GenBank中猪PD-1和PD-Ll的基因序列及原核表达载体多克隆酶切位点，设计其胞外区引物，以猪外周血单个核细胞(PMBC)cDNA为模板，应用PCR技术扩增PD-1、PD-Ll片段，并与pMD18-T-simpl。载体连接转化至DH5a中，通过菌液PCR及测序鉴定正确后，利用限制性内切酶分别对质粒pMD-PD-1,pMD-PD-L1及原核表达载体进行双酶切，利用TQDNA连接酶连接纯化回收的酶切产物，连接产物转化至DHSa中，经鉴定正确后转化至Rosetta中进行诱导表达，然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析。实验结果表明，通过PCR扩增获得了366bp的PD-1基因和645bp的PD-Ll基因。成功构建了重组表达载体pET-PD1和pET-PDL1，经SDS-PAGE分析，在28℃,0.5mmol/L IPTG条件诱导下获得了33ku左右的PD-1蛋白。在37℃,0.5mmol/L IPTG条件诱导下获得了43ku左右的PD-L1蛋白。两种蛋白均以包涵体形式存在。Western blot分析结果表示两个蛋白均能被其标签抗体所识别，也能被同源性较高的人的PD-1,PD-Ll单抗所识别，说明表达出的蛋白有良好的反应原性。本研究成功克隆出了猪PD-1、PD-L1胞外区目的基因，并表达获得了其目的蛋白，为其单克隆抗体的制备及PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制病中的作用奠定基础。
猪免疫学 程序性死亡分子1 基因克隆 原核表达
王选年 杨媛 朱艳平 孙国鹏 张艳芳 岳峰 李鹏
新乡学院,新乡453003
国内会议
2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会
南京
中文
46-46
2013-08-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）