重组chIL2表达纯化
为了进一步探索chIL2的生物学活性，设计一对包含Nde I和EcoRI限制性内切酶识别位点的引物，以本实验室保存的pMD-18T-chIL2重组质粒为模板进行常规聚合酶链式反应(PCR);分别对pET28a和PCR回收产物进行双酶切，酶切产物在T4 Ligase催化下连接过夜;连接产物转化Top10大肠杆菌进行重组质粒扩增，提取pET28a-chIL2重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌，IPTG低温(16℃)诱导目的蛋白表达，超声破碎细胞，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白;琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物大小约为450bp，与预期455bp一致;pET28a-chIL2重组质粒经双酶切鉴定、PCR扩增鉴定和碱基序列测定，结果均显示其正确性，chIL2基因碱基序列与GenBank中发表序列一致;转化获阳性重组子，挑取单菌并于37℃震荡培养至菌液OD600为0.6时，添加0.2mMIPTG并于16℃诱导表达4h。5OOOg离心3 min收集菌体细胞，超声破碎，12 000g离心10 min，得到上清和沉淀。上样缓冲液平衡镍柱，至蛋白纯化仪透过率T=100、吸光值O.5A=0;将Ni-NTA Agarose与离心上清混合并于翻转仪4℃翻转结合1h。结合完成后重装柱，50倍柱体积缓冲液快速淋洗，至吸光值为0。再分别用含有不同浓度咪唑(10 mM,30 mM,80 mM,250 mM)缓冲液进行洗脱，1mL/管收集各流出组分。SDS-PAGE电泳检测结果表明:重组目的蛋白经诱导在大肠杆菌中获得了高效表达，分子量大小约为18 kDa，目的蛋白含量占菌体总蛋白的28.5％。且以两种形式存在，即可溶形式存在于超声上清和包涵体形式存在于超声沉淀;30 mM咪哩浓度洗脱液能很好的洗脱与Ni-NTA Agaros。非特异结合的杂蛋白;;5个柱体积的80 mM咪哩浓度洗脱组分目的蛋白条带，带宽而深;250 mM咪哩浓度洗脱结果显示无目的蛋白条带，说明80 mM咪哩浓度洗脱液具有很好的目的蛋白洗脱能力。PBS(含10%甘油)透析、PEG20 000浓缩，得重组蛋白，纯度达90.1%，浓度为0.54 mg/ml。
重组鸡白细胞介素2 生物学活性 蛋白表达 质粒纯化
邓晨 张玉静 艾永兴 郑海南 吴山力 吕岩 张鑫 吴涵 王梦云 薛春玲 金雯
吉林大学,长春136000
国内会议
2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会
南京
中文
47-47
2013-08-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）