牛PLCζ-Venus真核载体的构建以及其在Hela细胞中的初步表达
本文从牛睾丸组织中提取总RNA,经RT-PCR克隆获得牛PLCδ1CDS全长，连接到本实验室提供的pMD19-T载体上，经DHSα转化后提质粒，经KpnI和NheI双酶切验证后送检测序。将测序结果与NCBI上公布的牛PLCδ1序列进行比对，测序正确后，选取鉴定结果正确的质粒和空pVenus载体各自进行KpnI和NheI双酶切并纯化回收目的片段和线性化的pVenus载体，通过T4DNA连接酶将目的片段和线性化的pVenus载体连接，后经DHS。转化后提质粒，经KpnI和NheI双酶切鉴定，而后在进行高纯度的质粒提取。提前在24孔板上接种培养Hela细胞，待其均匀分布贴壁达到70％-80%时用PLCδ-Venus转染Hela细胞，转染程序按照LipofectamineTM2000说明书进行操作。转染24h后在荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况。以空载体pVenus组和未转染组为对照。结果经PCR扩增PLC基因，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在约1900bp处出现特异性条带，回收的目的DNA片段连接pMD-19T在感受肤大肠杆菌中扩增，将所得质粒进行双酶切鉴定和测序对比，结果证明所回收的DNA片段确为牛PLCδl。在PLCδ-Venus转染Hela细胞相较于对照组死亡较多，在荧光显微镜下观察，出现了绿色荧光，荧光蛋白在细胞核周围呈弥散状分布。在pVenus转染组绿色荧光蛋白在整个细胞中都有分布。未转染组在荧光显微镜下观察时未观察到绿色荧光出现。讨论试验结果说明载体构建在分子水平和蛋白水平均验证正确。这有利于进一步研究牛PLCδ1在牛卵母细胞激活中的作用，并且为牛卵母细胞激活方法的改进与生物学激活方法的研究奠定基础。
牛 卵母细胞 真核表达载体 Hela细胞
宁静 许晓磊 许荣 李建 雷安民
西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心农业部动物生物技术重点开放性实验室,陕西杨凌712100
国内会议
第七次全国动物生物技术学术研讨会暨新疆畜牧科学院第六次学术年会
乌鲁木齐
中文
32-32
2013-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）