靶向preC/C基因特异性RNAi对乙型肝炎病毒在肝癌细胞系中复制与表达的影响
目的：探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV)preC/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果。方法：随机设计1个非同源对照21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4；为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C(E-C).将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞.运用ELISA检测转染后24h,48h,72h和96h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR(real-time PCR)进一步检测HBVmRNA转录产物cDNA的拷贝变化.结果：发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48h,与pEGFP-N 1单质粒转染相比,pU6-C1,pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低80％,而对照pU6-C4或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达,差异有统计学意义(P＜0.01)；免发现pU6-C1结果与显微镜观察/流式细胞仪细胞计数、ELISA和免疫荧光技术检测结果相吻合.抗病毒效果48h后作用明显,72h达到高峰.结论：发现靶向preC/C基因的RNAi能够有效特异抗HBV在人类肝癌细胞系中复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV/HIV有效的基因治疗技术.
乙型肝炎病毒 RNA干扰 基因疗法 表达载体
BIAN Zhong-qi 边中启 LIU Shuang 刘霜 LIU Ming-qiu 肖安 XIAO An 刘明秋 JIAO Ye 焦晔 YAN Wei-yao 严维耀 ZHENG Zhao-xin 郑兆鑫
Center for Infectious Diseases,CPLA Kunming General Hospital,Kunming 650032,P.R.China 中国人民解放军成都军区昆明总医院传染病中心 复旦大学遗传所
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2012-04-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）