粘孢子虫降解菌株的筛选及相关几丁质酶基因的克隆、表达与防治鱼类粘孢子虫病应用
(0) 粘孢子虫(Myxosporidia)，粘孢子虫纲的通称，是变温动物体内常见的原生动物类寄生虫，种类很多，其中绝大多数是专性鱼类寄生虫。粘孢子虫的寄生引起的粘孢子虫病给水产养殖业造成了巨大的经济损失。但由于粘孢子虫的成熟孢子外有一层几丁质壳瓣，具有强耐药力，至今也未筛选出一种低廉、安全、效应快的药物，使粘孢子虫病的防治成为一个难题。本实验采用取白天津的水产养殖池塘底泥作为样品，该养殖池塘曾经爆发粘孢子虫病，粘孢子虫病过后该池塘的养殖状况又自行恢复正常，这一现象说明该池塘底泥中可能存在潜在的降解粘孢子虫微生物。由于粘孢子虫的主要抗药能力集中在其几丁质壳瓣上，因此本试验的目的是从这一环境中分离得到具有降解其壳瓣能力的微生物，并克隆相关的几丁质酶基因。试验中首先设计了一对以糖苷水解酶18家族几丁质酶为主要目标的简并引物(GH18F/GH18R)。以池塘底泥微生物的宏基因组DNA为模板进行简并PCR扩增。建立了几丁质酶基因片段文库，并在库中检测到8条450bp左右的几丁质酶基因片段。这些片段与分别18和19家族几丁质酶有较高的同源性。试验结果说明这对几丁质酶简并引物能够有效地从池塘底泥微生物宏基因组中扩增出几丁质酶基因片段，并且所得的基因片段以18家族为主。通过几丁质酶筛选培养基和以粘孢子虫为唯一碳源的培养基两次筛选，确定一株几丁质酶活最高的菌株为潜在的粘孢子虫降解菌Aeromonas veroniistrain CD3。使用简并引物(GH18F/GH18R)从这株菌的基因组中扩增到了相应的几丁质酶片段。用TAIL-PCR的方法获得了该几丁质酶基因ChiCD3的序列全长。该基因全长为3054bp,编码1018个氨基酸和一个终止密码子。几丁质酶ChiCD3具有一长33 aa的信号肽，属于分泌型蛋白。将来源于Aeromonas veronii strain CD3的几丁质酶基因构建了pET-30a(+)-ChiCD3表达载体，转化E.coil BL21(DE3)，并成功在细胞内表达。最适温度测定结果表明，ChiCD3的最适反应温度为60℃。当反应温度为20℃时，ChiCD3的相对酶活为55％。最适pH值为4.0，在pH7.0时的剩余酶活为66％。该酶性质显示其基本符合在养殖环境中应用的条件。试验中测定天津爆发的粘孢子虫样品的18s rDNA序列，比对后显示与粘孢子虫纲、双壳目、碘泡虫属、单极虫Thelohanellus hovorkoi具有96％的相似性。用ChiCD3基因在大肠杆菌中表达的几丁质酶对粘孢子虫孢子处理，进行光镜检测，试验结果显示几丁质酶能够对粘孢子虫孢子的几丁质壳瓣有侵蚀降解作用。
粘孢子虫 几丁质酶 基因克隆 基因表达 降解菌株 鱼类粘孢子虫病
周志刚
中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点开放实验室,北京 100081
国内会议
2010年中国首届渔药研制与规范使用专题学术大会暨中国水产学会渔药行业协作网成立大会
上海
中文
138-139
2010-09-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）