全骨髓培养法对大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
目的：骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)约占骨髓有核细胞的1/10万，所以必须采用适宜的分离、纯化与培养的方法，并且采取严格的方法对其进行鉴定。本研究利用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞进行分离、纯化、培养以及鉴定，为临床上骨髓干细胞应用提供借鉴。方法：①全骨髓法分离培养BM-MSCs-断颈法处死Wistsr大鼠，完整提取胫骨、股骨，暴露骨髓腔，反复吹打冲出骨髓，使骨髓细胞充分分散制成单细胞悬液，再经200目不锈钢滤网过滤，以除去血污和骨渣，用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基稀释，置于37℃、体积分数5%C02细胞培养箱内培养，48小时后更换培养基，此后每3天换液一次，此细胞记为P0代。细胞长至70%-80%融合时，给予传代。②表面抗原鉴定：将P3代细胞滴加FITC标记的小鼠抗CD45单克隆抗体和PE标记的小鼠抗CD90单克隆抗体，流式细胞仪检测。结果：①骨髓冲洗液培养24小时后，可观察到培养瓶的底部出现少量细胞贴壁生长；第三天后增殖加速，梭形细胞逐渐成为优势细胞，7～10天后显微镜下细胞细胞体变得细长，呈漩涡状排列。②流式细胞仪检测提示表达CD45阳性率为1.3%、CD90阳性率为98.6%，符合骨髓间充质干细胞的特征。结论：骨髓间充质干细胞的分离与培养存在着全骨髓法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法等多种方式。本实验选用全骨髓方法筛选间充质干细胞，通过多次贴壁传代的方式去除杂质细胞，从而获得纯度较高的BM-MSCs，同时也保证了细胞的活性。骨髓间充质干细胞对体外培养的环境要求相对苛刻，本实验采用48小时首次换液、应用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基作为培养基，获得了纯度较高的骨髓间充质干细胞，且活性良好。
全骨髓培养法 骨髓间充质干细胞 体外培养 细胞活性
李大伟 高广周 李欣 孙涛
国内会议
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146-147
2011-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）