抗菌肽Shiva-1a基因真核表达载体的构建及序列分析
目的：在本研究中，利用重叠延伸PCR技术获得Cecropins抗菌肤Shiva la的成熟肤片段，通过分子克隆方法构建真核表达质粒，转染CHO- K1细胞，用荧光显微镜观察，并应用生物信息学软件分析和预测其二级和三级结构，旨在为进一步研究抗菌肤活性、作用机理和抗病转基因动物培育方面打下基础。方法：实验内容主要有Shiva la基因的合成及扩增、Shiva la基因的克隆、真核表达质粒的构建和提取、CHD-K1细胞的复苏、培养和重组质粒的转染和抗菌肽Shiva la序列分析和结构预测。结果：4条人工合成的特异性引物F1,R1,F2,R2进行重叠认的1.5%扩增后，经过1.5%的琼脂糖电泳，得到长度为147bp(含6XH is)的条带，与预期大小一致。将其与pMD18-Tsimple vertor连接转化后，提取质粒.利用限制性内切筋PstⅠ和BamHⅠ对pMD18-TShiva 1a进行双酸切鉴定，分别获得约147bp和2690bp左右的两条酶切片段,测序结果也表明克隆成功。将pMD18-T-Shiva 1a载体经双醉切、凝胶分离和回收目的片段后，与经相同酶切的表达载体pIRES2-EGFP连接，构建重组质粒，经酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功。用Ⅰ-TASSER server预测Shivala成熟肤的三维空间结构，用SPDBV进行显示，成熟欣的N端和C端均含有1个a-螺旋，为a-螺旋肽。结论：Shiva la为一种Cecropins类抗菌肤，是经过分子设计，在shiva l的氨基末端添加四个氨摹酸而获得，而Shiva 1具有广谱的抗菌活性，等同于抗菌肤cecropinB和SB-37。为了更好的了解抗菌肤Shiva la的抗菌机理和应川前景，本研究成功扩增到Shiva la的成熟肤部分，并在C端添加了6×His的标签，便于以后纯化；构建带有强荧光信号的真核表达质粒并转染CHO-K1细胞，显示抗菌肤能在真核细胞中表达，同时避免了形成包涵体的可能。
抗菌肽 Shiva-1a基因 真核表达 载体构建 序列分析
宫晓炜 郑福英 蔺国珍 曹小安 王光华 周继章 才学鹏
中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃 兰州 730046
国内会议
北京
中文
212-215
2011-09-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）