Kupffer细胞对日本血吸虫病肉芽肿期CD4+CD25+T细胞的影响
目的：血吸虫虫卵抗原引起的肝肠组织肉芽肿及随之发生的纤维化是慢性和晚期血吸虫病病人的主要病理表现。对血吸虫自然感染动物模型的研究发现，宿主免疫应答经历了一个从早期Th1型免疫应答转归到虫卵期Th2型免疫应答的过程。近年来研究表明，慢性血吸虫感染诱导宿主上调表达CD4+CD25+T细胞，能够抑制抗原特异性CD4+T细胞反应，下调Th1细胞水平。基于Kupffer细胞对机体的细胞免疫功能具有明显的调节作用，本研究探讨了Kupffer细胞对日本血吸虫感染小鼠CD4+CD25+T细胞以及肉芽肿的影响。<br> 方法：实验动物与阳性钉螺，6～8周龄雌性C57BL／6J小鼠(清洁级)，购自中国科学院上海实验动物中心，阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。主要试剂，流式抗体包括PE-Cy5标记的CD4、PE标记的CD25以及相应的同型对照抗体、免疫组化抗体Foxp3购自美国eBioscience公司。细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TGF-β和IL-10检测试剂盒为R＆D公司产品。氯化钆购自美国Sigma公司。肝功能试剂购自北京中生生物公司。动物分组与感染，6～8周龄雌性C57BL／6J小鼠分为对照组，感染组与感染／氯化钆组3组，每组各10只，其中感染组通过腹部感染尾蚴10条／只；感染／氯化钆组为在感染尾蚴后第4周经尾静脉注射氯化钆，剂量为每次15 mg／kg，每周2次；对照组则通过尾静脉注射PBS。CD4+CD25+T细胞计数，感染第8周无菌取肠系膜淋巴结和脾脏组织，分离单个核细胞。取1×106个细胞，分别加入PE-Cy5标记的CD4和PE标记的CD25各10 μl于标本管中，室温孵育20～30 min，并振荡混匀，洗涤1次，重新悬浮细胞，上流式细胞仪检测。细胞因子检测，采用小鼠ELISA检测试剂盒测定小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TGF-β和IL-10的表达水平，按照试剂盒操作说明书进行。将不同稀释度的标准品以及待测样本加入反应孔，每个样品作双复孔。根据不同浓度下标准品的吸光度(A值)绘制标准曲线，再根据待测样本的A值计算血清细胞因子的浓度。免疫组织化学染色检测Foxp3的分布，采用免疫组织化学(SP法)染色检测Foxp3的分布。小鼠肝脏置中性甲醛溶液中，石蜡切片脱蜡、水化；3％H2O2室温孵育5～10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，5％～10％正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；滴加10μl的抗小鼠Foxp3抗体，37℃孵育2h；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1％BSA-PBS稀释)，37℃孵育10～30 min；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育10～30 min，DAB显色；在高倍视野(×400)下，分别随机记数5个肉芽肿周围细胞中的染色细胞数。肝功能检测，摘眼球取血后，用枸橼酸钠抗凝，日立(HITACHI)-7060型全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和胆红素。统计学处理，统计学分析采用SPSS 11.5软件包处理，两组间比较采用t检验。<br> 结果：CD4+CD25+T细胞数量，本组研究显示感染组肉芽肿期CD4+CD25+T细胞数量为13.8％，对照组为6.4％，感染／氯化钆组为9.3％(P＜0.05)。Foxp3的分布，氯化钆降低肉芽肿周围表达Foxp3细胞的数量，感染组Foxp3细胞数量为(62±7)个，感染／氯化钆组为(45±4)个(P＜0.05)。细胞因子水平，感染组小鼠血清IL-10水平为41.4pg／ml，显著高于正常对照组的11.5 pg／ml，感染／氯化钆组为22.6 pg／ml(P＜0.01)。氯化钆还可降低IL-4和IL-5的水平，然但对IL-2、IFN-γ、以及TGF-β影响不明显。肝功能，对照组ALT水平为40.2 U／L，感染组为205.4 U／L，感染／氯化钆组为153.4 U／L(P＜0.05)，AST与胆红素变化不明显。组织学变化，氯化钆可减轻肉芽肿周围炎症反应程度。对照组肝组织切片镜下显示肝小叶结构正常，汇管区无虫卵沉积，无炎症细胞浸润，无纤维组织增生，肝细胞索呈放射状排列：感染组病理切片示，肝组织中出现较大的虫卵肉芽肿，周围有大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润；而感染／氯化钆组肝组织中虫卵肉芽肿较小，炎症细胞浸润也减少。<br> 结论：本研究结果显示，Kupffer细胞参与日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成，并调节一群具有免疫抑制功能的CD4+CD25+T细胞表达，上调Th 2细胞反应。因此，抑制Kupffer细胞功能可下调血吸虫病肉芽肿期CD4+CD25+T细胞的增殖和分化以及减轻肉芽肿周围的炎症反应，这将有可能为慢性血吸虫感染及其纤维化的治疗寻找一条新的途径。
日本血吸虫病 肉芽肿 Kupffer细胞 CD4+CD25+T细胞 免疫功能
杨江华 贺蕾 王涛 杨进孙 侯为顺
皖南医学院弋矶山医院感染性疾病科 241000
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356-357
2010-05-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）