内质网应激在大鼠暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其相关机制
目的：暴发性肝衰竭(FHF)是由多种原因引起的大量肝细胞急性坏死和严重肝功能损伤所致的临床综合征。暴发性肝衰竭具有起病急、进展迅速、并发症多、病死率高、预后极差的特点，是当前国内外研究的热点和难点，其发病机制仍未完全阐明。目前研究认为，暴发性肝衰竭与肝细胞凋亡密切相关，但其具体作用机制尚不清楚。内质网应激是除死亡受体活化和线粒体损伤外又一条新的介导细胞凋亡信号传导的通路，与许多肝脏疾病相关，是目前国内外研究的热点。内质网(ER)是细胞内最大的膜网络结构，具有合成、加工蛋白参与代谢和细胞信号处理功能。内质网应激(ERS)是指由于某种原因导致细胞内质网生理功能发生紊乱，钙稳态失衡，错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理状态，是使错误的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工所必需的步骤，是一种细胞自我保护的机制。但是过强或长时间的内质网应激则可能导致细胞凋亡。内质网应激反应过程中，当大量膜蛋白在内质网沉积时，可激活内质网超负荷反应(EOR)，NF-κB(nuclear transcription factor κB)被活化，在EOR信号通路中需肌醇蛋白1(IRE1)处于中心地位，IRE1是内质网跨膜蛋白，参与内质网应激反应的适应、警戒、凋亡三个阶段，内质网应激时IRE1活化，聚集肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)。引起NF-κB活化。NF-κB是一种广泛存在于细胞中具有多向性调节作用的核转录因子，与细胞凋亡关系密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控，具有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的双重作用。而且有研究表明TRAF2可通过激活NF-κB诱导激酶(NIK)激活NF-κB。Caspase-12是鼠类内质网膜结合蛋白，能够且仅被内质网应激导致的凋亡活化。近年来发现内质网应激介导的细胞凋亡与乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病、阿尔茨海默病和糖尿病等密切相关，而在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用如何报道较少。本研究应用免疫组化及反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测检测D-氨基半乳糖(D-GalN)和脂多糖(LPS)诱导的大鼠暴发性肝衰竭模型肝组织NF-κB、IRE1、NIK、Caspase-12表达情况，通过采用常规苏木素-伊红(HE)染色，流式细胞学技术(FCM)观察肝细胞凋亡情况，分析Caspase-12表达与肝细胞凋亡程度、内质网跨膜蛋白IRE1的相互关系，探讨内质网应激在暴发性肝衰竭中的作用及机制，分析NF-κB活性与肝细胞凋亡程度、内质网跨膜蛋白IRE1及NF-κB诱导激酶NIK的关系，探讨IRE1介导NF-κB激活的信号转导通路在暴发性肝衰竭发病机制中的作用，为阐明暴发性肝衰竭的发病机制和防治提供理论依据。<br> 方法：1 研究对象：雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体重180-200g。大鼠禁食24小时后，随机分为2组，即模型组和对照组，每组30只。模型组腹腔注射D-GalN800mg／kg，之后皮内注射LPS1Oug／kg制造暴发性肝衰竭模型，对照组注射同样体积的生理盐水。2 标本采集和保存：从对照组、模型组各取6只分别于给D-GalN+LPS后2、4、8、12、24小时行股静脉放血处死，立即剖腹取出肝脏，取适量肝组织分别固定于10%中性甲醛液、70％乙醇中，部分肝组织经液氮速冻后存放于-80℃冰箱。3 HE染色光镜下观察肝组织病理学变化。4 采用免疫组织化学pv法检测肝组织中NF-κB p65、IRE1、NIK、Caspase-12蛋白表达情况。5 采用RT-PCR方法检测肝组织中NF-κB、IRE1、NIK、Caspase-12mRNA的表达情况。6 应用流式细胞学技术测定肝细胞凋亡率(AR)。7 分析NF-κB、IRE1、NIK、Caspase-12与肝组织病理、肝细胞凋亡的关系及其各检测指标间的相互关系。8 统计学处理：应用spss13.0统计软件进行统计学分析，采用方差分析，秩和检验和Spearman秩相关分析对数据进行统计。<br> 结果：1 一般状况观察：对照组大鼠一般状况较好，无死亡；模型组大鼠随着给药时间的延长出现活动减少、反应迟钝、毛发竖立、嗜睡、昏迷等情况。2 肝组织形态学观察：(1)大体标本观察：对照组大鼠肝脏基本正常；模型组大鼠肝脏随着给药时间的延长出现充血、出血点及淤血斑逐渐增多，到24小时肝组织呈暗红色，大片出血，淤血严重。(2)HE染色：对照组大鼠肝组织基本正常；模型组大鼠肝组织病理显示给药后2小时肝小叶完整，肝索排列规则；4小时可见肝细胞嗜酸性变及凋亡小体，少量炎细胞浸润；8小时可见灶状坏死，伴炎细胞浸润，可见多量凋亡小体；12小时肝细胞片状坏死，可见炎细胞浸润，可见凋亡肝细胞；24小时肝组织大片坏死，出血严重，残留散在肝细胞及凋亡小体。3 细胞凋亡的变化：流式细胞学技术检测细胞凋亡率结果显示在模型组2h、4h、8h、12h肝细胞凋亡率随着给药时间延长呈现上升趋势(p＜0.05)；对照组肝细胞凋亡率较低(P＞0.05)，各时间点较模型组细胞凋亡率减少(p＜0.05)。4 肝组织Caspase-12检测结果：(1)免疫组化方法：模型组Caspase-12蛋白主要表达在肝细胞浆，随着给药时间的延长表达增多(P＜0.01)；对照组肝细胞胞质Caspase-12蛋白表达均为阴性，未检测到Caspase-12蛋白表达(P＞0.05)。(2)RT-PCR结果显示：模型组Caspase-12 mRNA表达随着给药时间的延长而增加，8h达高峰，以后逐渐下降，各时间点差别有统计学意义(P＜0.01)，对照组Caspase-12 mRNA各个时间点弱表达，无明显差别(P＞0.05)，在4h、8h、12h、24h，模型组Caspase-12 mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.05)。5 肝组织IRE1 α检测结果：(1)免疫组化方法：模型组IRE1 α蛋白主要在肝细胞浆表达，随着给药时间的延长，IRE1 α蛋白表达明显增多(P＜0.01)：对照组肝细胞胞质可见IRE1 α弱表达，各时间点比较差别无统计学意义(P＞0.05)。(2)RT-PCR结果显示：模型组随着给药时间的延长IRE1 αmRNA表达增高，各时间点比较差别有统计学意义(P＜0.01)；对照组IRE1 α mRNA各个时间点表达无明显变化(P＞0.05)，各时间点模型组IRE1 α mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.05)。6 肝组织NF-ΚB检测结果：(1)免疫组化方法：模型组大鼠肝组织随着给药时间的延长，NF-ΚB表达逐渐增多(P＜0.01)；对照组肝细胞胞核可见NF-ΚB弱表达，各时间点比较无统计学意义(P＞0.05)。(2)RT-PCR结果显示：模型组NF-ΚB mRNA随着给药时间的延长表达逐渐增加，12h达到最高值，24h较12h有所下降，各时问点比较差别有统计学意义(P＜0.01)；对照组NF-ΚB mRNA各个时间点表达无明显差别(P＞0.05)，在4h、8h、12h、24h，NF-ΚB mRNA表达模型组均明显高于对照组(P＜0.05)。7 肝组织NIK检测结果：(1)免疫组化方法：模犁组NIK蛋白主要在肝细胞胞浆表达，NIK蛋白表达水平在给药后各时间点差别无统计学意义(P＞0.05)：对照组肝细胞胞浆NIK表达呈阴性，各时间点比较差别无统计学意义(P＞0.05)。(2)RT-PCR结果显示：模型组随着给药时间的延长NIK mRNA各时间点表达差别无统计学意义(P＞0.05)；对照组NIK mRNA各个时间点表达无明显变化(P＞0.05)，各时间点NIK mRNA表达模型组均明显高于对照组(P＜0.05)。8 Caspase-12与IRE1 α、细胞凋亡率的相关性分析：Caspase-12与IRE1 α、细胞凋亡率均成正相关(r=0.733，P=0.000；r=0.586，P=0.001)。9 NF-ΚB与细胞凋亡率、IRE1 α、NIK的相关性分析：NF-ΚB与细胞凋亡率、IRE1 α均成正相关(r=0.515，P=0.004；r=0.763，P=0.000)；NF-ΚB与NIK无相关性(P＞0.05)。<br> 结论：1.利用D-Ga1N联合LPS制造暴发性肝衰竭大鼠模型，从形态学、细胞学以及基因水平证实了肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭病理过程中起着重要作用。2.在实验性暴发性肝衰竭中，随着肝脏病理损伤的加重肝组织中IRE1 α、Caspase-12表达增加，Caspase-12与IRE1 α、细胞凋亡率呈明显正相关，提示内质网应激参与了暴发性肝衰竭的发生发展，IRE1 a／TRAF2／Caspase-12介导的信号转导通路是内质网应激导致暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的重要机制之一。3.在实验性暴发性肝衰竭中，随着肝脏病理损伤的加重肝组织中NF-ΚB表达增加，且与肝细胞凋亡率呈明显正相关，从细胞、蛋白、基因水平证实NF-ΚB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中起重要作用。4.在实验性暴发性肝衰竭肝组织中NF-ΚB与IRE1 α呈明显正相关，但与NIK之间无相关关系，提示NF-ΚB可能在内质网应激信号转导通路中起重要作用，但在IRE1a-TRAF2-NF-ΚB这一信号转导通路中，连接TRAF2与NF-ΚB的信号转录分子：NIK对NF-ΚB无明确调控作用。
暴发性肝衰竭 细胞凋亡 核转录因子-KB 内质网应激 发病机制
甄真 刁青 葛海燕 赵彩彦 周俊英
河北医科大学附属第三医院感染科 050051
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429-432
2010-05-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）