重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制和代谢优化-猪α干扰素的高效表达
在5-10L规模发酵罐下,对一株高产猪α干扰素(pIFN-α)重组毕赤酵母高效表达生产pIFN-α的最优化发酵工艺进行了系统性研究。研究发现,1)使用基于人工神经网络模式识别的控制系统(ANNPR-Ctrl),可以实现重组毕赤酵母高密度培养的高效化、自动化和通用化。在细胞生长期,采用ANNPR-Ctrl控制系统流加底物,可以将整个培养期的底物浓度控制在一个较低的水平,在相同培养时间下表达猪α-干扰素和植酸酶的重组毕赤酵母细胞浓度分别比使用DO-Stat法控制时提高了81％和44％,有效地缩短了培养周期。2)传统300C甲醇诱导条件下,甲醇浓度控制在10g／t,左右的水平,O2消耗速度(OUR)高而稳定,pIFN-α抗病毒活性高,最高抗病毒活性可达到6．7x106IU／mL。3)但此工艺条件并不能保证能得到具有高pIFN-α活性的发酵产品,故障发酵是因为培养期的不适当甘油流加、导致重组毕赤酵母细胞骨架或功能不健全所致。利用多状态变量在线测量和聚类分析的方法监控底物(甘油和O2)比消耗速度与细胞比生长速度之间的关系,可以在第一时间及时地发现故障或采取措施排除故障,为高效稳定的毕赤酵母发酵生产pIFN-α工艺的形成提供了条件,pIFN-α抗病毒活性可稳定在1．0×106 IU／mL,以上,达到摇瓶发酵条件下相应活性的300倍。4)在5-10L罐上,降低诱导温度到20℃有利于改善发酵性能指标。与30℃下的同类指标相比,醇氧化酶(AOX)活性可提高50-300％,甲醇比消耗速度可增加1倍,O2比消耗速度可增加20-40％,pIFN-α表达活性可提高10-20倍,细胞对于培养／甲醇诱导环境切换的适应期从5-10 h缩短到1h。另外,200C诱导条件下,发酵系统对外部干扰、特别是甲醇过量添加的抵御能力大大提升,细胞可以耐受40．g／L以上甲醇的冲击。发酵系统在20℃下的高甲醇抗冲击能力有利于降低过程对甲醇精密测量和控制的要求,强化发酵过程的操作稳定性。5)在5L罐下,提出了低温(20℃)诱导与高溶解氧耦联控制发酵生产pIFN-α的新工艺,使用该工艺条件可以解除因供氧不足所导致的能量运转的劣化,促使pIFN-α有效表达时间延长,pIFN-α抗病毒活性最高可达3．62×107IU／mL。6)在10L罐下,利用多变量在线检测和代谢分析的手段,研究了诱导温度对碳代谢流分配与能量再生效率／速度的影响和规律,并对中大型罐下的最优和可实现的操作模式进行了初探。结果显示,降低诱导温度不但可以提高AOX活性和pIFN-α的表达水平,还可以造成胞内产能途径和目标物质合成途径的代谢流分配比例的改变,可以强化走向pIFN-α合成途径的碳代谢流通量。更加重要的是,20℃诱导条件下,产能途径中所生成的NADH可以得到有效的利用,提高了ATP再生效率,绝对ATP再生速度也增加近50％,使得毕赤酵母发酵生产外源蛋白的整体效率得到改善。7)对传统甲醇诱导和甲醇／山梨醇共混诱导下甲醛异化途径和TCA循环途径中关键酶活性进行了比较分析。结果表明,甲醇／山梨醇共混诱导使细胞能量供应途径发生了改变,甲醛异化产能途径明显被弱化,而TCA循环产能途径则被强化,从而有效缓解了细胞的能量供应压力及甲醛异化产能途径中的毒副产物甲醛对细胞的毒害作用。30℃诱导下,能量体系运转正常,10 L发酵罐下的最高pIFN-α抗病毒活性达到1．8×107IU／mL,发酵成本明显下降,提高了整体发酵性能。
重组毕赤酵母 外源蛋白 过程控制 猪α干扰素 高效表达
史仲平
江南大学生物工程学院 教育部工业微生物重点研究室
国内会议
济南
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2011-08-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）