戊型肝炎病毒(4型)ORF2蛋白抗原性特征及其在诊断中的应用
目的：戊型肝炎(戊肝)病毒(hepatitis e virus，HEV)感染是我国急性肝炎的常见原因，诊断戊肝主要依靠抗-HEVIgM检测。目前检测试剂盒所用HEV抗原来自于1型病毒，而我国以4型HEV为主。而且，现有试剂盒存在较多的假阳性。因此，有必要对含有4型HEV主要抗原决定簇的第二开放读码框(open reading frame 2，ORF2)多肽特性和抗原性特征进一步研究，并在此基础上，开发高灵敏度和高特异性的抗-HEV IgM检测试剂盒，为正确诊断戊肝提供保证。 方法：用RT-PCR法从戊肝患者血清中扩增HEV ORF2基因片段，用T-A克隆法将ORF2基因插入pGEM-T载体，DNA序列分析，确定HEV的基因型。然后通过表达载体pRSET-C，在大肠杆菌中表达ORF2蛋白主要抗原决定簇多肽(459-607位氨基酸)以及其截短多肽(459-594位氨基酸和472-607位氨基酸)，纯化后在不同条件下用SDS-PAGE分析其特性，Western blotting分析其抗原性特征。然后以459-607多肽和472-607多肽为抗原分别包被ELISA板，用间接法检测已知戊肝患者血清和其他血清与这两种多肽的反应性，进一步用Western blotting验证，并用RT-PCR检测血清HEV RNA。 结果：经DNA测序，证实克隆的ORF2来源于4型HEV。含有ORF2蛋白主要抗原决定簇多肽459-607以及羧基端和氨基端的截短肽(459-594和472-607)均能在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE显示，459-607以及羧基端和氨基端的截短肽(459-594和472-607)均能在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE显示，459-607多肽在SDS和二巯基乙醇中，不加热时，能以二聚体和单体两种形式存在，100℃加热处理后，仅以单体形式存在；而459-594多肽和472-607多肽，不管是否加热，都是以单体形式存在；说明ORF2多肽形成二聚体需要459-607位氨基酸。Western blotting结果显示，抗-HEV仅与ORF2 459-607多肽的二聚体反应，而不与单体反应；抗-HEV也不与两种截短肽反应。说明ORF2多肽的抗原性取决于ORF2的二聚体结构。用459-1607多作为抗原，间接ELISA法检测19例已知抗-HEVIgM阳性血清，结果均为阳性，69例已知抗-HEV IgM阴性血清，结果均为阴性。说明459-607多肽作为检测抗原具有敏感性高，特异性强的优点。而19例抗-HEV IgM阳性血清均不与472-607多肽反应。对5例经Genelabs试剂检测为阳性、而与临床不符合的血清标本检测发现，这些血清既能与459-607多肽反应，也能与472-607多肽反应，且两者的OD450值相似。进一步经Western blotting分析，显示无一例抗HEV IgM阳性，巢式RT-PCR检测也无一例HEV RNA阳性，证实这5例血清均为假阳性。这些结果说明，如果血清能与472-607多肽反应，而且其程度与459-607多肽反应程度相当。则高度提示是因为非特异性吸附引起的假阳性。 结论：4型HEV ORF2多肽二聚体的形成依赖于459-607位氨基酸，459-607多肽的抗原性取决于二聚体结构。459-607多肽能灵敏地检测抗-HEV IgM，采用ORF2截短肽(472-607多肽)可以有效排除抗-HEV IgM检测中的假阳性。
戊型肝炎病毒 ORF2蛋白 抗原性特征 间接法检测 临床诊断
周乙华 潘金顺 吴超 毕永春 孙静 唐勤
南京大学医学院 附属鼓楼医院感染科 检验科 (210008)
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170-175
2008-06-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）