聚球藻7942生物钟基因KaiA的克隆与敲除载体的构建
蓝藻是至今已证明具有生物钟，这种内源计时系统的最简单生物.即使一天内细胞分裂速度超过一次，生理节律仍然以近似昼夜周期进行。蓝藻极为简单的结构却具有极为多样的代谢途径，如光合放氧和固碳，呼吸吸氧和放CO2，固氮和产氢等，有些相互促进，也有些相互干扰。为了协调这些多途径代谢，除了有相应结构外，生物节律的调节也是一个重要方面。已经证明，蓝藻的生物钟周期与环境光暗周期接近时，细胞具有更强的竞争优势。KaiA基因是蓝藻具有的3个生物钟基因中最年轻的一个，只存在于蓝藻中。这种基因的长度因种类而异。在单细胞蓝藻长852-900bp；这是丝状体蓝藻的1.5-2倍。它也是3个基因中最不保守的，在同一属中，聚球藻7942与耐热聚球藻中的KaiA氨基酸序列只有43.6”％”的同源性。KaiA表达的蛋白以二聚体存在，每个亚基有284个氨基酸，它的主要功能是正向调节KaiC的磷酸化：而且它还是启动子PkaiBC的正效应因子，能增强KaiBC的表达。本研究的目的是想用反向遗传学方法研究KaiA的功能。从NCBI查得聚球藻7942KaiA基因碱基序列，依此设计引物，并请公司合成:然后用PCR技术克隆KaiA基因；把基因连接在T载体pMD-18上；用它转化大肠杆菌DH5α；经筛选酶切，PCR鉴定，确定已与T载体连接，送公司作基因测序；经BLAST鉴定，克隆的基因序列与公布的同源性为100”％”，所得KaiA基因的长度855bpo把pMD18-KaiA载体和质粒pRL-489用BamH I和Sal I双酶切；回收酶切的目的基因KaiA和质粒pRL-489大片段;用T4DNA连接酶连接这两个大片段:转化大肠杆菌DHSa，涂板后用卡那霉素筛选阳性克隆；从大肠杆菌转化子中提取pRL489-KaiA载体，做酶切和电泳，鉴定KaiA基因的插入，证明敲除载体pRL489-KaiA已构建好。
聚球藻 生物钟基因 KaiA基因 基因克隆 敲除载体
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2009-11-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）