不同pH值的载ACEshRNA-PEG化壳聚糖纳米粒的制备及其对大鼠主动脉内皮细胞转染的研究
目的:制备不同pH值的PEG化壳聚糖质粒纳米粒,研究PEG化壳聚糖纳米粒的特性与其对DNA的结合及保护能力,以及对大鼠主动脉内皮细胞的ACE mRNA表达水平。 方法:采用离子交联法制备不同pH值的壳聚糖纳米粒,通过静电吸附作用连接上ACE基因特异性shRNA的干扰质粒;用喷金扫描电子显微镜检测,了解粒径的分布与形态；经琼脂糖凝胶电泳分析PEG化壳聚糖纳米载体与质粒DNA的结合能力,及不同pH值的PEG化壳聚糖纳米粒对质粒DNA的结合能力；用紫外分光光度计检测PEG化壳聚糖纳米粒对质粒的包封率；并通过Dnase Ⅰ消化PEG化壳聚糖纳米-质粒结合物以观察PEG化壳聚糖纳米载体对质粒的保护作用:采用贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,选择生长良好的第34代细胞用于实验；分别用40ul、60ul、80ul、100ul、150ulPEG化壳聚糖质粒纳米复合物对内皮细胞转染；选取转染效率最高的一组与空白对照组及质粒对照组,采用实时荧光定量-PCR技术测定细胞中ACE mRNA(24h、48h、72h)的表达。 结果:喷金扫描电镜检测证实PEG化壳聚糖纳米粒的粒径随溶液体系的pH值升高而增大,当pH值为5.5时其粒径呈均匀分散的球形颗粒,平均直径为5 nm；琼脂糖凝胶电泳的结果显示PEG化壳聚糖纳米粒能有效地结合质粒；不同pH值的PEG化壳聚糖纳米粒对质粒的保护作用不同,当pH值<7时PEG化壳聚糖纳米载体能100％结合质粒；DnaseⅠ消化试验证实PEG化壳聚糖纳米载体对质粒DNA有保护作用；经流式细胞仪检测100ul转染效率最高,与其它量之间比较差异有统计学意义(P<0.05)；转染PEG化壳聚糖质粒纳米复合物后24小时细胞.ACE mRNA表达水平下降了(14.7±5.9)％,48小时为(53.6±5.4.)％,72小时为(60.1±2.1)％；在48h时质粒对照组细胞的ACEmRNA表达水平下降了(0.6±0.3)％,与PEG化壳聚糖质粒纳米复合物组相比有统计学差异(P<0.05)。 结论:采用离子交联法制备出粒径较小、均匀的PEG化壳聚糖纳米粒,并且PEG化壳聚糖纳米粒能有效地连接上质粒并对其有保护作用；经过优化转染条件,经PEG修饰后的壳聚糖质粒纳米复合物可以将重组质粒pACE-shRNA高效转染入大鼠血管内皮细胞。
PEG化壳聚糖纳米粒 主动脉内皮细胞 pH值 离子交联法
肖传实
山西医科大学第二医院心内科 030001
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116-123
2009-07-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）