会议专题

基于肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7 EspA的高效融合表达载体的设计、构建及应用研究

目的:构建基于EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)的高效原核融合表达载体,并对此载体的通用性和应用性进行研究。 方法:在EspA的羧基端设计-Lin-ker,包括柔韧区.肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增espA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白的表达。SDS-PAGE检测融合蛋白。融合蛋白EspA-IL-24、EspA-GFP经亲和层析纯化后进行肠激酶酶切实验,酶切后样品离心取上清进行SDS-PAGE检测。融合蛋白EspA-Stx2A1经纯化复性后,分别从免疫原性和免疫保护性两个方面对融合蛋白的生物学活性进行研究。 结果:构建的pEspA可高效表达外源目的蛋白。融合蛋白:EspA-GFP、Es-pA-IL24经肠激酶酶切后,SDS-PAGE均可检测到目的蛋白条带,提示酶切成功。纯化、复性后的融合蛋白EspA-Stx2A1具有良好的免疫原性,在体内和体外均具有良好的免疫保护效果。 结论:成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,此载体的构建不仅方便EHEC O157:H7基因工程多亚单位融和蛋白疫苗的研究,也为构建具有自主知识产权的高效、稳定、低成本、易纯化的重组蛋白表达系统奠定基础。

大肠杆菌 细菌感染 免疫学检验 蛋白表达

程琰 毛旭虎 王庆旭 余抒 刘艳青 张晓丽 宁亚蕾 邹全明

第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆,400038

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2009-10-01(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)