Atelocollagen胶原支架在三维培养心肌组织中的作用
目的：目前培养细胞和组织的方法多局限于二维培养研究，三维培养因没有理想的支架材料而进展缓慢，本研究旨在探讨Atelocollagen胶原支架在三维培养心肌组织中的生物相容性，寻找二维培养心肌组织的条件和理想的支架材料。 方法：选用新生1dSD乳期大鼠10只，无菌条件下剪取心脏，放入预冷无Ca2+、Mg2+的Hanks液中清洗三次，洗净红细胞，将心室肌剪成大小约1mm3的组织块，用酶消化法(0.125％胰蛋白酶、0.1％I型胶原酶和0.1％透明质酸酶)在恒温振荡器内(37.0℃，60r/min)对心室肌组织块进行心肌细胞分离，将分离的细胞悬液用含15％胎牛血清(fetal boyine serum，FBS)的DMEM终止消化并离心(1200r/min，10min)，再用含15％FBS的DMEM制成细胞悬液接种到培养瓶放入培养箱(37.0℃，596CO2)2小时。利用差速贴壁的方法对大鼠心肌细胞和成纤维细胞进行纯化，把纯化后的细胞悬液接种到胶原纤维支架上，对第8天、第16天、第20天在Atelocollagen胶原纤维支架上生长的细胞进行动态观察、HE染色、扫描电镜和透射电镜观察。 结果： ①Atelocollagen胶原支架的形态特点：横切面上，光镜下呈大小不等的六边形的多孔状，孔的直径约200～400微米。HE染色下呈均质红染，弯曲；Masson染色呈深红色;亮绿染色呈绿色。电镜下可呈现微弱的横行或斜形的横纹。Atelocollagen是一种生物性胶原，对生物体无抗原性和毒副作用，目前已用于美容除皱。 ②细胞在Atelocollagen支架上的生长规律：培养4小时后，在倒置显微镜(TE2000-U，Nikon)下，可观察到心肌细胞开始贴壁生长，初为圆形，后为梭形，偶见单个搏动的心肌细胞。第1天搏动频率为16次/分，律齐，连同支架一起搏动，形成细胞胶原支架搏动复合体；第3天搏动频率为23次/分，律齐；第4天频率约为73次/分；第6天搏动频率为124次/分；第8天搏动频率为166次/分；培养10天以后细胞搏动的频率随培养时间的延长而逐渐减慢，10天时搏动频率为144次/分左右，16天时减为95/分，20天为48次/分。HE染色显示，第8天心肌细胞核明显，有多核现象，肌纤维清晰、相互交错在一起，未发现闰盘，肌纤维无空泡现象，细胞与支架紧贴融合，有的细胞融入支架之中；16天未见细胞数目的增多，肌纤维无空泡现象，发现似毛细血管的结构；20天心肌细胞核明显，有多核及核吲缩现象，肌纤维清晰、相互交错在一起，闰盘不明显，肌纤维有空泡现象。 ③细胞在Atelocollagen支架上生长的亚维结构：在透射电镜(H-7500)下显示，不同阶段培养的各类细胞(包括纤维细胞、内皮细胞、心肌细胞等)生长正常，有些孔内充满大量的细胞。培养第8天，观察剑细胞膜边缘与支架紧贴，有的伸出伪足样突起与支架融合在一起，有的细胞纤维细胞和内皮细胞于支架两侧相伴行很长距离，贴在支架的两侧并与支架融合，少数细胞长在支架内；培养第16天，支架孔内的细胞数量未见减少。细胞成分和形态无明显变化，未见细胞凋亡现象：第20天发现部分细胞轻度水肿，有空泡及凋亡现象现象，但支架内的细胞数量无明显减少。在三个不同阶段的培养过程中均能发现细胞在支架壁的两侧紧密相贴和融合。在扫描电镜下发现细胞在胶原纤维支架上贴附并充分伸展，在胶原纤维支架表面细胞相互融合成片状生长，与胶原支架融合性好。 结论：Atelocollagen是一种脱去具有抗原性基团的生物胶原，具有很好的生物相容性。可作为三维培养细胞和组织的天然材料，有望成为再生医学的理想支架。
Atelocollagen 胶原支架 心肌组织 生物相容性 支架材料 三维培养细胞
郑先杰 常连生 郭志坤 郁小兵 张红旗 徐振平 王庆志 蔡新华
新乡医学院心脏形态学研究室 河南新乡 453003 日本高研公司 日本东京
国内会议
昆明
中文
307-308
2006-10-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）