高效液相色谱法直接测定芳香族氨基酸
本文用高效液相色谱-紫外检测法直接测定了芳香族氨基酸。流动相为TritionX-100(1％)胶束、磷酸二氢钾溶液(25mM，pH=6.0)和甲醇的混合溶液，其体积配比为9：60：23，TritionX-100的加入缩短了保留时间，使氨基酸得到了更好的分离。流速为1.0 mL/min，检测波长为257nm，柱温T=35℃，4min内完成。在最佳实验条件下，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸得到很好的分离效果。酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的线性范围分别为：5-500μg·mL-1、15-20000μg·mL-1、5-2000μg·mL-1。检测限分别为：2μg·mL-1、5μg·mL-1、1μg·mL-1。用该方法测定了啤酒，十七种氨基酸混合溶液，粮食样品中酪氨酸的含量，结果令人满意。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)、色氨酸(Tryptophane，Trp)等。定量分析芳香族氨基酸在蛋白质化学和临床诊断与研究中有着十分重要的意义”1,2”。分析氨基酸的方法很多，其中高效液相色谱法(HPLC)”3-4”是分析它的常用方法。文献”4”用梯度洗脱在不同波长处分别测定酪氨酸，苯丙氨酸及色氨酸，在7min内测试完成。本文利用高效液相色谱法(HPLC)-紫外检测，检测波长为257nm，同时测定苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的含量，该法无需衍生和梯度洗脱，有着较宽线性范围，较低的检测限以及分析时间短。且其它氨基酸在紫外无吸收，不影响测定。因此，该法可用于氨基酸原料约和注射液中酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)的测定。 本实验使用日本岛津LC-10AVP高效液相色谱仪，Class-VP色谱工作站，Hamilton 80365进样器。Varian C18色谱柱(5μm，150mm×4.6mm i.d.)。分别选择了乙腈，各种pH值的缓冲液，各浓度的NaAc，KH2PO4及甲醇作为流动相。当A泵为乙腈，B泵为25mM的KH2PO4能达到较好的分离效果，但考虑到经济因素，将乙腈换为甲醇，保留时间有所增长，分离效果有所下降。试验了向其中加入TrionX-100微乳液，CTAB，SDS，TritionX-100，TritionX-114等胶束溶液及β-CD。TritionX-100的加入使保留时间缩短，分离效果加强。试验表明，当A泵为甲醇，B泵为TritionX-100(1％)与25mM的KH2PO4的混合溶液(体积比为15：100)，且A：B=75:25(体积比)时，L-Trp，L-Phe，L-Tyr得到很好的分离。因此，流动相为：25mmol/化气LKH2PO4-TritionX-100(1％)-甲醇(体积比为9：60：23，用磷酸调节至pH=6.0)。流动相使用前采用0.45μm的有机微孔滤膜过滤(Millipord，MA)并进行超声脱气。检测波长为257nm，进样量20μl。分别取浓度为100μg·ml-1，100μg·mL-1，100μg·mL-1的L-Trp，L-Phe，L-Tyr溶液，用紫外-可见分光光度计在200～800nm处扫描，它们的最大吸收波长分别为L-Trp：280nm，L-Phe：257nm，L-Tyr：275 nm。在280nm和275 am时，仅L-Tip和L-Tyr有谱峰出现。在257nm处L-Trp、L-Tyr、L-Phe均出峰。因此选择257nm为测定波长。 此外，对影响HPLC的物理参数也进行了优化。试验了不同浓度KH2PO4并用磷酸调节不同pH值的结果以pH=6.0为最好。在KH2PO4，TritionX-100及甲醇的体积配比不变的情况下，改变体系的pH值，测定三种氨基酸，当pH值为5.5～6.0时，保留时间几乎不变。由于Trp，Phe，Tyr的等电点分别为5.89，5.48，5.66，pH=5时远离三者的等电点，可以避免因等电点处氨基酸具有最小溶解度，容易析出，且三者都携带负电荷。因此，选择流动相的pH值为6.0。本文试验了流速分别为0.5、1.0、1.5ml/min时对保留时间的影响，流速越大，保留时间越长，考虑到实际情况，选择1.0ml/min，考虑了柱温对保留时间的影响。随着柱温的升高，保留时间越来越短。最终选择T=35℃。在最佳实验条件下，测定了三种氨基酸的混合溶液。研究了其他氨基酸对测定的影响，所以其他氨基酸对实验测定无影响。按照实验方法，在优化条件下测定工作曲线。
高效液相色谱 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 紫外检测
朱霞石 徐素琴
扬州大学化学化工学院,扬州 225002
国内会议
长沙
中文
627-628
2009-04-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）