自温控一次性实时荧光定量PCR芯片方法研究
”目的”：酶链聚合反应(PCR)通过温度循环可对给定目标DNA实现数百万的放大，不仅是分子生物学研究的重要手段，现也已经成为临床诊断和检验检疫的重要手段。通常的阴阳性分析已经不能满足实际需要，因此定量PCR分析也正在成为日常分析测试的项目。实时定量PCR(qRTPCR)借助荧光探针通过在温度循环过程中实时检测荧光信号的变化与目标DNA的原始拷贝数进行关联。目前常用的台式系统价格昂贵，试剂消耗较大，且速度较慢。微全分析系统的提出为qRT PCR的小型化创造了条件，从而使基于PCR的现场分析及床边护理成为可能。微型化(芯片化)的PCR通常采取两个策略实现温度程序循环。一是流动PCR，反应体系在泵的推动下于微通道中通过不同温度的区域实现温度循环；二是静态PCR，反应体系静置于反应池中，反应池的温度经过时间程序变化实现温度循环。后者具有操作简单的特点，也为实时荧光测定提供了方便，通过一次性使用的方法可以克服交叉污染等问题，但是对系统的动态温度控制提出了更高的要求。针对如上要求，我们基于透明的导电玻璃基材研究开发了一种具有自温控特性的价廉的静态芯片PCR方法，以SYBR为染料，蓝色LED为光源，利用芯片透明的特点实现了温度循环过程中的实时荧光信号测定，展示了其用作微型化qRT PCR的前景。 ”方法”：利用ITO玻璃导电的特点，直接利用该导电膜为加热材料，借助温度传感器可实现芯片温度时间程序控制。利用该导电膜的温阻特性，该导电膜同时可用作温度传感器，从而实现无时间滞后的反馈控制。实验得到温阻特性曲线及时间温度循环曲线，未经优化系统的升降温速度分别可达20和8。C/sec以上。直接在芯片上粘接反应池即可形成开放的PCR反应池。为了放置温度循环过程中的试剂挥发，在反应体系上覆盖石蜡油。作为可行性展示，以配置LED光源和PMT的倒置显微镜为实验平台，将该芯片系统置于载物台上形成简易的实时荧光定量PCR系统。利用该芯片平台实现了静态PCR和温度变化过程中的荧光信号检测。采用的是10uL反应体系，包括2×SYBR Green qPCR Mix 5uL；上游引物O.5uL；下游引物0.5uL；模版0.2uL，补双蒸水至10uL，体系中加入模版DNA的量为3.82×107拷贝。两温度循环下连续记录扩增中荧光信号的变化及退火阶段荧光信号水平与温度循环次数的变化关系如图5所示。 ”结果和结论”：ITO玻璃是工业化生产的基础材料，因此价廉易得，加之其导电和透明的特点成为静态芯片PCR的理想的基础材料，为一次性qRTPCR芯片的开发创造了条件。该方法具有开放，透明和简易的特点，通过检测系统的小型化可成为便携式qRT PCR的原型。该方法也可作为功能单元与芯片电泳系统结合，共用荧光检测单元从而在实现定量的同时用分离检测的方法对目标片段进行确证，从而确保分析结果的可靠性。
荧光定量PCR 荧光探针 ITO玻璃 温度控制
吴志勇 陈坤 田晓溪 王晓杰 方芳
东北大学分析科学研究所,沈阳 110004
国内会议
海南三亚
中文
36-38
2007-12-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）