白喉毒素无毒变异体CRM197的表达及作为结合疫苗蛋白载体的初步应用
目的：利用基因工程技术在大肠杆菌中对CRM197进行克隆表达，探索是否可以得到能够产生重组CRM197的大肠杆菌重组菌株，对重组蛋白进行纯化，并考察重组CRM197作为蛋白载体是否具有可行性，增加我国结合疫苗的载体类型。 方法: 提取白喉棒状杆菌C7/β197株基因组DNA为模板，运用PCR技术扩增crml97基因。构建PCR 2.1-TOPO/crm197重组克隆质粒，双酶切鉴定后，筛选阳性克隆进行基因测序分析，然后将序列正确的crm197基因克隆人表达载体pET28a中，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTC诱导表达，采用金属镍离子亲和层析纯化重组目的蛋白，免疫印迹法对重组CRM197进行鉴定。重组CRM197的初步应用：用溴化氰活化A群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)，以ADH作为连接剂，以重组CRM197为蛋白载体，在EDAC的作用下制备GAMP-rCRM197结合物；结合物经凝胶过滤层析纯化，产物进行理化性质检测。然后将 GAMP、GAMP+rCRM197混合物和GAMP-rCRM197结合物分别经皮下免疫接种Balb/c小鼠(18～20g)，免疫剂量为2.5μg多糖/只。间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异的IgG抗体，对结合物的免疫原性进行初步分析。 结果: 重组CRM197在大肠杆菌BL21(DE3)中主要以包涵体形式表达，表达量占全菌体蛋白的25％左右，经纯化后重组CRM197纯度达到95％以上，免疫印迹法证明重组CRM197具有良好的抗原性；将重组CRM197与A群脑膜炎球菌多糖偶联制备了GAMP-rCRM197结合物，对结合物的免疫原性进行了初步分析，结果证明结合物中的多糖具有良好的免疫原性，重复接种产生了免疫增强效应，初步说明重组CRM197起到了载体蛋白的作用。 结论: 本课题初步达到了研究目的，说明以重组CRM197作为蛋白载体具有可行性，为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗，奠定了实验基础。
CRM197 白喉毒素 蛋白载体 结合疫苗 A群脑膜炎球菌疫苗 PCR扩增 基因测序 生物制品
王春娥 叶强 李凤祥
中国药品生物制品检定所,北京,100050
国内会议
北京
中文
41-46
2007-10-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）