猪源致病性大肠杆菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区的SSOP分析
DNA旋转酶基因gyrA中喹诺酮耐药决定区碱基变换在大肠杆菌对喹诺酮的耐药性方面起着十分重要的作用。采用PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)技术可对大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变进行有效检测。本文以142株猪源致病性大肠杆菌氟喹诺酮药物敏感菌株为样本,测定了细菌对喹诺酮药的MIC值,结果表明142株猪源大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率分别为78.8％,56.3％,65.5％,76.8％。猪源大肠杆菌对氟喹诺酮药物的耐药率高,且耐药菌株MIC值较大。菌株WJPE2-1(对环丙沙星的NIC为0.5μg/mL)的诱导耐药试验,结果表明,在通过药物浓度梯度连续诱导过程中获得了MIC为2,8,64,128μg/mL的四株诱导菌株,诱导菌株4对ENR、NOR、OFL、CIP的MIC值分别增加到诱导前的32,128,128,256倍,且4株诱导菌株对CIP、ENR、NOR、OFL的MIC值均呈现递增.根据GenBank注册的大肠杆菌gyrA序列设计引物,横跨gyrA的第40和118密码子位置,包含完整的QRDR,从27株不同MIC值的大肠杆菌株、ATCC25922、4株诱导耐药菌株均获得约300bp的PCR产物。采用29:1的交联度、12％的聚烯酰胺浓度,1×TBE,凝胶中添加5％的甘油的条件,对诱导菌株、药物敏感菌株及不同耐药水平的分离菌株进行SSCP分析,结果表明,诱导菌株的谱型与敏感对照菌不同,低MIC值菌株SSCP谱型与敏感对照与敏感对照一致性高；耐药菌株的谱型多数与敏感对照不同.四株诱导大肠杆菌PCR产物的SSCP谱型均与对照不一致,检出率为100％；27株不同耐药性的猪源大肠杆菌中,7株敏感大肠杆菌共有6株的SSCP谱型与标准敏感菌株对照一致,符合率为85.7％；20株耐药大肠杆菌其谱型与标准敏感对照一致的菌株为2株,检出率为90.0％。序列比较结果表明,敏感菌株WJPE2-1的PCR产物与敏感对照有2个碱基(第91,111位氨基酸残基位置)的差异,序列同源率为99.16％(236/238)。诱导菌株1与2表现在第83位氨基酸编码序列由tcg突变为ttg,菌株3、4与菌株1、2的差异表现在第87位氨基酸编码序列由gac突变为tac.进一步分析发现,菌株WJPE2-1在第91位及111位的突变均为同义突变,即密码子的变换没有引起氨基酸残基的改变.在诱导菌株中,1与2的gyrase的第83位氨基酸残基由Ser→Leu,菌株3、4的gyrase还在第87位氨基酸残基由Asp→Tyr.表明由于QRDR内碱基的改变,引起DNA旋转酶氨基酸的变化,导致大肠杆菌产生氟喹诺酮药物的耐药性。
大肠杆菌 耐药性 喹诺酮
吴祥辉 王红宁
四川农业大学动物科技学院,四川,雅安,625014
国内会议
成都
中文
17-17
2003-09-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）