人瘦素的原核表达、蛋白纯化及其降低胆固醇作用研究
目的:通过分子克隆和原核表达获得人瘦素在大肠杆菌的高效表达,了解纯化的产品对胆固醇代谢的影响,提出瘦素为内源性降低动脉粥样硬化危险的活性因子的可能性. 方法与结果:瘦素cDNA的获取:从天津市儿童医院急性肠梗阻手术患儿皮下脂肪组织中提取总RNA.设计上、下游引物,以该总RNA中的瘦素mRNA为模板,RT-PCR后获瘦素cDNA.将其连接于原核表达载体pBV220上.对目的基因进行自动测序,结果表明,本研究获得的瘦素cDNA缺失第二个外显子的前三个碱基CAG,即由该cDNA编码的成熟肽少第28位谷氨酰胺残基.瘦素的原核表达:将该重组质粒转化大肠杆菌,诱导获得瘦素的稳定、高效表达.瘦素的表达量约占细菌总蛋白的40％.表达的瘦素以包涵体形式存在.瘦素的纯化:包涵体以4.6M尿素溶解后,通过逐步降低变性剂浓度,缓慢复性.离心弃沉淀,上清则经过Sephacryl S-200柱层析,获得初步纯化的重组瘦素.重组瘦素的活性:整体实验表明,每只正常小鼠每日腹腔注射20ug瘦素,小鼠体重第1天即降低,第2和3天继续降低,第4天则开始稍升高.小鼠饲料摄入量与体重的变化趋势相一致.这一结果表明,瘦素可能存在多肽性.缺失第28位谷氨酰胺残基的重组瘦素也一样具有减少小鼠饲料摄入量、降低体重的活性.重组瘦素降低胆固醇的作用:纯化获得的重组瘦素可降低摄食高胆固醇小鼠血浆总胆固醇和LDL-胆固醇的作用. 结论:瘦素存在多肽性,缺失第28位谷氨酰胺残基的重组瘦素具有减少小鼠饲料摄入量、降低体重的活性.并可降低摄食高胆固醇小鼠血浆总胆固醇和LDL-胆固醇的作用.推测它可能为降低动脉粥样硬化危险的内源性活性因子.
瘦素 动脉粥样硬化 胆固醇 原核表达 蛋白纯化
刘佃辛 王长岭 金宏 许志勤
卫生学环境医学研究所,天津,300050 山东省临沂市卫生学校,临沂,276030
国内会议
北京
中文
74-81
2000-10-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）