乙型肝炎病毒e抗原相互作用蛋白基因的克隆化及功能的初步研究 (摘要)
乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝细胞损伤的机制,与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用密切相关.而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBVDNA前-C基因区编码的一种非颗粒性的分泌蛋白,随HBV复制而增加,临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一.因此研究HBeAg与肝细胞内蛋白的相互作用及其机理,能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释,并为寻找有效防治方法提供新线索.酵母双杂交技术是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的方法.本实验所采用酵母双杂交系统-3,基于两种单倍体酵母a和α型可以配合形成二倍体,而其中表达的外源蛋白仍能相互作用的机理,免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题,大大提高了杂交效率;在原技术基础上增加了3个报告基因,降低了假阳性率.我们利用该技术,根据中国HBV流行株序列设计引物,应用多聚酶链反应(PCR)技术,由乙型肝炎患者血清中分离出HBeAg编码基因序列.经测序鉴定正确后,克隆人酵母表达载体pGBKT7中构建”诱饵”质粒,转化酵母细胞AH109(a型),表达后通过Western-blotting鉴定产物活性.随后与预转了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187(α型)进行配合,经营养缺陷和蓝白斑双重筛选,获得了HBeAg结合蛋白阳性克隆245株.提取阳性克隆酵母质粒,通过Cacl2穿孔法转化大肠杆菌,接种于氨苄青霉素-LB平板,筛选阳性克隆并进行序列测定.测序结果在GenBank中进行生物信息学分析,发现未知功能的新基因有6条,已知蛋白基因35条。
乙型肝炎病毒 肝细胞损伤 乙型肝炎e抗原 HBeAg 蛋白基因克隆 酵母双杂交
李伯安 毛远丽 戚扬 何卫平 程云
解放军第三○二医院临检中心,北京,100039
国内会议
长沙
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352-356
2005-10-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）