单细胞逆转录PCR实验方法研究
目的:探索建立稳定可靠的单细胞逆转录PCR实验体系.方法:以SV40病毒转染的永生化人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)为实验对象,制备单细胞悬液后,在倒置显微镜下用微吸管吸取单个细胞,加入到预先加好细胞裂解液的0.2ml薄壁PCR反应管中进行逆转录PCR.以人β-actin和DPH2L基因为靶基因,引物特异性扩增单个细胞中目的基因,用含有OligodT24的Poly(A)PCR引物序列非依赖性扩增单个细胞中的全部mRNA,通过各个环节上实验条件的比较优化,对这两种单细胞逆转录PCR方法的扩增效果进行了深入的研究,并通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术,分析了该方法的灵敏性、特异性、重复性和忠实性.结果:优化确定了各个环节的实验条件,建立了稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系;引物特异性扩增分别从单个细胞中有效扩增得到了β-actin和DPH2L的特异性产物,并无其他非特异性条带,扩增成功率可达90﹪,扩增产物的DNA测序结果经与GeneBank数据库进行比对分析为100﹪吻合;SC-Poly(A)PCR亦从单个细胞中序列非依赖性的有效扩增了全部mRNA,扩增成功率为75﹪,扩增产量可达μg水平,足够其他常规研究所用;各组对照显示整个实验过程没有受到外源性DNA污染,同时基因组DNA在该程序中也不能被扩增.结论:证实单细胞RT-PCR具有很好的灵敏性、特异性、重复性和忠实性,建立了稳定可靠的单细胞逆转录PCR实验体系,为单细胞水平上基因表达研究提供了强有力的工具.
单细胞 逆转录 PCR mRNA
熊杰 韩玲 朱丹
第二军医大学海军医学系放射医学教研室,上海,200433
国内会议
昆明
中文
178-184
2005-10-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）