克莱博氏菌青霉素G酰化酶的克隆、表达及性质研究
青霉素G酰化酶(EC 3.5.1.11,PGA)能水解青霉素G产生6-氨基青霉烷酸(6-APA),6-APA是半合成青霉素的关键中间体;另外,作为生物催化剂,PGA在许多有潜在价值的反应中也发挥了重要作用,例如多肽合成中保护氨基和羟基;PGA还可应用于氨基酸、β-氨基酯、胺类等手性化合物的拆分.拆分得到的纯的对映异构体可用作合成有生物活性组分的中间体.现已在许多微生物体内发现有该酶存在,如各种细菌、放线菌、真菌和酵母等.虽然大肠杆菌的PGA是工业应用上最为重要的来源,开发和应用其他来源的PGA也取得令人鼓舞的成果.与大肠杆菌的PGA相比,来自克莱博氏菌的青霉素G酰化酶具有对温度、pH的耐受性,与有机溶剂的共溶性,而且易固定化等优点.然而,到目前为止,对来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶的研究还主要集中于分子特性以及低物特异性的研究,系统地利用基因工程技术、发酵工程技术来研究和开发此酶在工业生产上的应用还未见报告.因此,本研究首次已来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶为研究对象,利用PCR技术扩增出编码克莱博氏菌青霉克G酰化酶,克隆入质粒pET28b,获得一个C端含6个组氨酸的融合蛋白表达载体pET28b/Kc-PGA.此融合蛋白在E.coli BL21(DE3)成功表达.最适IPTG诱导浓度为5μM.利用Ni-IDT层析柱可一步纯化此融合蛋白,获得比活力达35.3U/mg,得率为89﹪,纯化达23倍.数据显示,此重组酶对pH和温度稳定,它的最适pH和温度分别为8.5和55℃.Km和Vmax分别为17.6μM.和23.8U/mg.重组的KcPGA的高得率和高比活力以及其他的一些动力学性质,为进一步研究和开发它作为有工业应用前景的固定化催化剂奠定了良好的基础.
青霉素G酰化酶 克莱博氏菌 融合蛋白 药物中间体 制药生物化学
文勇 周珮
复旦大学药学院(上海)
国内会议
杭州
中文
241-246
2004-12-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）