金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的B细胞免疫优势表位鉴定及其表位疫苗研究
目的： 系统筛选并鉴定SEB的B细胞免疫优势表位，并分析相应优势表位的生物学功能;构建并表达涵盖SEB的免疫优势及亚优势B细胞表位的多表位融合蛋白疫苗，并评价其在抗MRSA感染中的保护作用。 方法: 本文从以下两部分展开论述： 第一部分:SEB的B细胞免疫优势表位筛选及其功能鉴定 1.因SEB毒性与其超抗原活性密切相关，为评价重组SEB突变了(rSEB)的毒性，用不同浓度的rSEB或天然SEB毒素分别刺激BALB/c小鼠脾淋巴细胞，分析rSEB刺激T细胞异常增殖及刺激脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-y及TNF-a的能力。 2.用A1P04佐剂辅助SEB突变了(rSEB)免疫BALB/c小鼠，在三次免疫之后进行MRSA252菌株的尾静脉攻毒实验，分析rSEB蛋白疫苗在预防MRSA252感染中的效果，并采集rSEB免疫后小鼠的血清，分析血清中SEB抗体效价，评价SEB抗体应答在MRSA感染中的作用。 3.合成覆盖SEB全长的42条重叠18-肽，以上步获得的SEB抗血清为一抗，用肽ELISA法分析各个重叠18-肽与SEB的结合能力，系统筛选与SEB具有优势结合能力的线性B细胞表位肽。以SEB全蛋白作为阳性对照，以无关肽OVAI192-201和无关蛋白BSA作为阴性对照。用统计学软件SPSS13.0作非配对T检验来分析各个吸光度值。 4.在弗氏佐剂辅助下，用免疫优势18-肽-KLH的偶联物免疫BALB/c小鼠，经三次免疫后获得表位肽抗血清。以SEB天然毒素为包被抗原，用问接ELISA法检测不同稀释度的表位特异性抗血清与SEB天然毒素的结合能力。 5.针对每个已筛选出的SEB免疫优势表位，从N-端及C-端分别依次截断2个氨基酸，合成多个截断肽，分别以截断肽为包被抗原，以相应优势表位肽抗血清为一抗，用问接ELISA法分析各个截断肽与相应18-肽抗血清的结合强度，明确所筛选表位的核心序列。进一步，表位肽抗血清以不同浓度稀释，再次用ELISA法筛选与相应抗血清结合最强的截断肽，即优势表位核心序列。 6.在动物模型中获得表位核心序列的抗血清，在体外进行SEB毒素中和实验，明确所筛选的SEB免疫优势表位的功能。在弗氏佐剂辅助下，用免疫优势表位核心序列一KLH偶联物免疫BALB/c小鼠，经末次免疫后7天获得表位核心序列的抗血清，在体外分析该表位核心序列的抗血清阻断SEB毒素的刺激T细胞增殖及脾淋巴细胞分泌IL-2, IFN-y及TNF-a的能力。 7.在Uniprot蛋白数据库中检索不同金黄色葡萄球菌菌株来源的SEB氨基酸序列，NCBI网站上进行同源性比对，明确所筛选的SEB优势表位在不同金黄色葡萄球菌菌株中的序列保守性。在Pubmed protein data base数据库中下载SEB晶体结构图，用PyMOL 1.1软件分析SEB免疫优势表位在SEB晶体结构中的位置，分析SEB免疫优势表位在SEB晶体结构中的位置。 8.采用肽ELISA法分析SEB优势表位与临床MRSA(+)血清的交义反应性，以此评价SEB优势表位在人体中的应用前景。以SEB的优势表位为包被抗原以SEB抗血清为阳性对照，以临床SEB抗体C)血清为阴性对照。 第二部分:SEB的多表位疫苗制备及其保护功能评价1.利用基因工程技术构建含SEB优势表位及亚优势表位的疫苗蛋白的原核表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组SEB多表位融合蛋白;用SDS-PAGE鉴定蛋白该表达形式;用Western Blot分析该蛋白的免疫原性及免疫反应性;经离了交换层析纯化该蛋白;对蛋白进行进行N端氨基酸测序;用BCA法检测蛋白浓度。2.分别在弗氏佐剂及A1P04佐剂辅助下，用SEB多表位蛋白或rSEB免疫BALB/c小鼠，三次免疫后经尾静脉对小鼠进行MRSA252菌株攻毒，分析不同免疫组小鼠在MRSA252感染后14天的生存状态，评价该疫苗对小鼠抗金黄色葡萄球菌感染的保护效果。 3.用ELISA法检测小鼠的抗血清滴度，分析各组疫苗免疫后特异性抗体的效价。ELISA法检测SEB多表位疫苗的血清中抗SEBIgG抗体的水平，评价SEB多表位疫苗抗体应答在中和SEB毒素中的作用。分别以疫苗中的各个表位为包被抗原，ELISA法检测疫苗的抗血清与疫苗中每个表位的结合强度，评价疫苗中每个表位特异性抗体的应答水平。 4.无菌收集不同免疫组存活小鼠的心、肝、肺及肾脏，研磨获得各脏器组织的悬液，选用生理盐水作不同稀释度稀释，进行细菌涂板，通过菌落计数、革兰染色及PCR法计算各脏器中MRSA252的数量，评价在免疫攻毒后小鼠各脏器中细菌的定植量。 结论:本实验通过重叠肽ELISA,B细胞表位特异性抗体的中和毒素活性试验、抗原表位的生物信息学及临床血清学分析，筛选并鉴定出了SEB的三个免疫优势应答B细胞表位，揭示了SEB体液免疫在抗MRSA感染中的保护机制，不仅发现了SEB的新表位SEB207-222，而且揭示了已报道的SEB表位的核心序列SEB97-112:及SEB247-257。通过基因工程技术构建并获得了SEB多表位疫苗，进一步通过该疫苗的动物保护实验，并证明了SEB的多表位融合蛋白疫苗具有显著的预防和清除MRSA感染的免疫保护作用，为MRSA疫苗提供了新的研究思路和设计策略.
金黄色葡萄球菌肠毒素B B细胞 免疫优势 表位疫苗 动物模型
赵卓 吴超 邹全明
第三军医大学药学系微生物与生化药学教研室&国家免疫生物制品工程技术研究中心
国内会议
四川西昌
中文
1-32
2014-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）