以亲环素 A 为靶点的高通量药物筛选模型的建立及应用
亲环素A(CypA)是免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)的胞内受体,与多种重要生理和病理过程密切相关,已经成为如免疫抑制、抗HIV、HCV等多类药物的研发靶点。为了筛选新的靶向CypA的药物,本研究建立了一个基于荧光偏振方法的CypA抑制剂药物高通量筛选模型。应用PCR方法 从人外周血淋巴细胞中扩增出CypA基因,通过大肠杆菌系统重组表达CypA蛋白,并利用镍离子螯合亲和层析柱进行蛋白纯化。SDS-PAGE检测重组表达的CypA相对分子质量约为19 kDa,蛋白纯度大于90％。经过荧光偏振测定体系中重组CypA和示踪剂FITC标记CsA浓度的优化,确定了最佳的荧光偏振反应条件,使其信号本底比为2.04,Z’因子为0.71。阳性药CsA对模型的验证结果证明能剂量依赖地与荧光标记的CsA竞争结合于CypA,其IC50值为221.3 nM。利用建立的筛选模型,本研究对28215个微生物次生代谢产物粗提物进行了初筛和复筛,从中筛选得到43个抑制率大于70％的样品。经液相-质谱方法进一步分析,其中17个真菌的发酵产物中含有CsA类化合物。方法的验证以及应用结果证明该基于荧光偏振的CypA抑制剂药物筛选模型具有很高的灵敏度和稳定性,可以简单、快捷地进行靶向CypA的药物高通量筛选。
亲环素A 环孢菌素A 高通量筛选 荧光偏振法
郑海洲 郑智慧 可爱兵 任晓 范玉玲 路新华
华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄 050015
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101-106
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）